UVRAG介导二烯丙基二硫(DADS)诱导白血病K562细胞自噬

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目的研究UVRAG在二烯丙基二硫(DADS)诱导白血病K562细胞自噬中的作用,初步探讨DADS诱导K562细胞发生自噬的分子机制。方法1)体外培养K562细胞;不同浓度(10mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L)DADS作用K562细胞12h后,利用透射电子显微镜观察K562细胞的超微结构自噬体的形成;及40mg/L DADS作用不同时间(3h、6h、12h、24h)K562细胞后,采用吖啶橙染色,荧光显微镜观察自噬囊泡的形成以检测DADS诱导K562细胞自噬;2)通过RT-PCR法从转录水平检测UVRAG mRNA在不同浓度(10mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L)DADS处理K562细胞12h后的表达水平;3)通过Western Blotting法从蛋白水平上检测在不同浓度(10mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L)DADS处理K562细胞12h后UVRAG蛋白表达水平。结果1)不同浓度(10mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L)DADS作用K562细胞12h后,透射电镜观察显示不同浓度DADS处理组可观察到胞质或胞核内出现具有双层膜结构的自噬小体,而空白组、溶媒组未观察到自噬小体。2)40mg/L DADS处理K562细胞3h、6h、12h、24h后,通过吖啶橙染色荧光显微镜下观察可见到DADS处理不同时间(3h、6h、12h、24h)K562细胞后,细胞胞浆中可呈现橙红色斑点状的酸性囊泡(即为自噬泡),随着时间的增加,细胞胞浆中的酸性囊泡有增多的趋势,其中40mg/L DADS处理K562细胞12h后,细胞胞浆中的橙红色斑点状的酸性囊泡最明显,而给药24h后细胞胞浆中的橙红色斑点状的酸性囊泡数量有所下降,可能与随着时间的延长,酸性囊泡被降解有关。3)RT-PCR检测UVRAG mRNA表达水平结果显示,不同浓度(10mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L)DADS作用K562细胞12h后,UVRAG mRNA表达水平分别为0.621±0.025,0.671±0.019,0.812±0.009,0.738±0.044,而空白对照组为0.554±0.018,溶媒对照组为0.572±0.018,药物处理组UVRAGmRNA表达水平均高于对照组(差异具有统计学意义,P<0.05),而对照组之间表达强度无明显差异(P>0.05)。4)Western Blotting检测UVRAG蛋白表达水平结果显示,不同浓度(10mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L)DADS作用K562细胞12h后,UVRAG Actin的灰度值分别为0.731±0.044、0.812±0.069、1.151±0.175、0.880±0.071,而空白对照组、溶媒对照组分别为0.293±0.072、0.251±0.031,药物处理组UVRAG蛋白表达水平均高于对照组(差异具有统计学意义,P<0.05),而对照组之间表达强度无明显差异(P>0.05)。结论二烯丙基二硫可诱导白血病K562细胞自噬;其机制可能与UVRAG介导的自噬通路有关。
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