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海洋是微生物资源的一大宝库,其独特的生态系统造就了具有独特功能的海洋微生物。本研究以从中国南海深海海泥中分离得到的88株细菌为出发菌株,经过平板活性测试、粗脂肽产率分析和HPLC测定,确定SHB114和NB66为目标菌株。通过摇瓶发酵及产物分离纯化得到抗真菌活性良好的脂肽类化合物。主要结果如下。
(1)以黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)为靶菌通过琼脂平板扩散法测定待选深海来源细菌抑制真菌活性,得到活性良好的19株细菌。选取其中粗脂肽产率较高且脂肽种类丰富的SHB114和NB66为实验菌株。
(2)通过形态学特征观察、生理生化特性分析与16S rDNA序列进化树比对将SHB114鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该种细菌首次于2010年报道分离自水稻根系土壤,目前尚无在海洋中分离得到的报道。NB66鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
(3)SHB114发酵液经酸沉淀、有机溶液抽提、快速硅胶柱色谱、中低压制备液相色谱与RP-HPLC逐级分离,并配合活性追踪,得到3个抗丝状真菌的iturin家族的脂肽类化合物SHB114-A、SHB114-B与SHB114-C。采用核磁共振光谱(NMR)与质谱(MS),将此3个化合物分别鉴定为bacillomycin Lc0#、bacillomycin Lc2#及bacillomycin Lc4#。
(4)在浓度为1 mg/mL时,SHB114-A、B、C对黄瓜炭疽病菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌、杉木枯萎病菌等多种植物病原菌有抑制活性。其中SHB114-C活性最强,琼脂平板扩散法测得其抑制黄瓜炭疽病菌和立枯丝核菌的最低抑菌浓度均可达60μg/mL,有防治作物真菌病害的研发价值。
(5)NB66发酵液经酸沉淀、有机溶液抽提、快速硅胶柱色谱与RP-HPLC逐级分离,并配合活性追踪,得到2个抗丝状真菌的iturin家族的脂肽类化合物NB66-A、NB66-B。采用NMR与MS将此2个化合物鉴定为iturin A-6、iturin A-8。
(6)体外活性实验中,NB66-A显示出对立枯丝核、杉木枯萎病菌、苹果干腐病菌等多株植物病原真菌的较强抑制活性。NB66-B活性较弱,高浓度时可以抑制黄瓜枯萎病菌、苹果干腐病菌和小麦赤霉病菌的生长。鉴于NB66生长迅速,可以迅速抢占营养空间,亦有成为生防细菌的潜力。