论文部分内容阅读
斑马鱼已成为发育和遗传学研究的理想模式动物，但缺乏胚胎干细胞和基于胚胎干细胞的基因敲除技术，已成为限制斑马鱼基因功能研究快速发展的关键因素。ENU处理诱导基因组突变后的突变体筛选、基因定向克隆和以此为基础的TILLING基因敲除技术，在突变品系建立和基因功能研究方面正发挥着重要作用，然而基因组点突变的局限性和突变体鉴定方法的复杂性，决定了这些技术尚不能满足斑马鱼基因功能研究快速发展的需要。近年来，利用SB和To12转座子介导的基因组插入突变方法，已在模式鱼胚胎发育过程中鉴定出一些重要的功能基因，但整体效率尚低，亦未获得可稳定遗传的突变体品系。造成突变效率低下的可能原因:1）捕获元件的功能未得到充分的验证;2）转座子插入基因组的拷贝数低（≤100拷贝），转座子在基因组中未能有效地再迁移。我们在深入研究SB转座机制和分析现有基因捕获载体缺陷的基础上，设计和构建出两个由SB转座子介导的基因捕获载体，用于斑马鱼胚胎发育过程中功能基因的捕获，该载体允许捕获功能基因的同时获得斑马鱼突变体品系。
我们的主要研究结果包括:1）构建SB转座子介导的基因捕获和poly(A)捕获载体，对捕获元件进行功能验证;2）采用基因捕获和poly(A)捕获载体在HeLa细胞中捕获了一系列基因，并有效地干扰了这些基因的表达;3）证明罗非鱼热激蛋白70启动子、斑马鱼热激蛋白70启动子具有显著的热激诱导活性，能够诱导转座酶的表达，实现捕获载体再迁移;4）采用Cre/Loxp系统实现了诱导性启动子介导的转座酶的切除;5）研制出3000尾携带基因捕获和poly(A)捕获的转基因鱼，建立亲代转基因斑马鱼品系;6）通过和野生型杂交获得携带转座子捕获载体的F1代转基因鱼;7）对6尾不同亲本来源的F1代阳性鱼进行插入位点分析，确定l尾转基因鱼中捕获基因为Mamdc2。
本文报道了SB转座子介导的插入突变技术，在细胞和活体水平证明了此技术的可行性。这项技术的成功实施将为斑马鱼功能研究提供技术平台，亦为建立斑马鱼基因突变品系库奠定基础。