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背景及目的癫痫(epilepsy,EP)是神经内科最常见的慢性脑部疾病之一。癫痫发作严重影响了患者及其家庭的生活质量,也给社会带来了重大的负面影响。动物模型和临床研究已经表明,长时间的癫痫发作和癫痫持续状态可造成脑部多个区域的神经元凋亡,其中海马神经细胞受损最为明显。Omi/Htr A2(high-temperature requirement serine protease A2)是一种线粒体丝氨酸蛋白酶,属于促凋亡因子,可通过半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteiny aspartate specific protease,caspase)依赖途径或者非caspase依赖途径参与细胞凋亡。在正常的生理情况下,成熟的Omi/Htr A2主要储存于线粒体内、外膜之间的膜间隙中。有研究表明,当细胞受到刺激产生应激反应时,凋亡诱导因子作用于线粒体,使线粒体外膜通透性增加,Omi/Htr A2进入细胞质,结合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAPs),并使其裂解,从而解除IAPs对caspase-3、7、9的抑制,激活caspase级联放大反应,引起细胞凋亡。同时,各种凋亡刺激作用于细胞时,Omi/Htr A2通过其蛋白水解活性,可降解或清除线粒体抗凋亡蛋白(HIS-associated protein X-1,HAX-1),激活不依赖caspase的细胞凋亡途径。Omi/Htr A2丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂(undetermined certain factor,Ucf-101)是Omi/Htr A2的特异性抑制剂,它通过抑制其活性,阻断Omi/Htr A2的caspase和非caspase依赖凋亡途径,从而发挥抑制凋亡的作用。已有研究表明,Ucf-101对心、肺、肾等器官的细胞具有保护作用,而且可减少脑缺血-再灌注及神经退行性病变所引起的神经元凋亡,但其对癫痫大鼠海马神经元的作用目前国内外鲜有报道。本研究通过建立氯化锂-匹鲁卡品(Lithium-pilocarpine,PILO)诱导SD大鼠癫痫持续状态(status epilepticus,SE)模型,采用HE、Nissl、TUNEL及免疫组化染色法检测海马组织损伤及细胞凋亡情况,观察Ucf-101对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元凋亡的影响,并通过检测神经元中Omi/Htr A2、caspase9及HAX-1表达水平的变化,来初步探讨其中的可能机制。材料与方法160只健康雄性SD大鼠,6-8周,体重200-250g,随机分为CON组、PILO组、PILO+DMSO组、PILO+Ucf-101低剂量组和PILO+Ucf-101高剂量组,PILO组包括2h组、6h组、12h组、24h亚组,每组各20只。所有SD大鼠均行腹腔注射氯化锂(127mg/kg)预处理。20h后对PILO组、PILO+DMSO组、PILO+Ucf-101组进行腹腔注射匹鲁卡品(30mg/kg)处理,为了拮抗匹鲁卡品的外周胆碱能作用,在此之前的30min需要皮下注射氢溴酸东莨菪碱(1mg/kg)。并且在注射匹鲁卡品前10min,PILO+Ucf-101低剂量组和PILO+Ucf-101高剂量组需要分别腹腔注射Ucf-101 0.7umol/kg和1.5umol/kg,PILO+DMSO组用等体积的DMSO代替Ucf-101。CON组腹腔注射等体积的生理盐水代替匹鲁卡品。根据Racine痫性发作分级标准,达到Ⅳ或Ⅴ级为造模成功。SE持续60min后腹腔注射地西泮(10mg/kg)终止发作。记录各组大鼠致痫成功率、存活率及发作潜伏期。取CON组、PILO 24h亚组、PILO+DMSO组及PILO+Ucf-101组造模成功且存活的大鼠总数的一半麻醉后灌注取脑,采用HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及免疫组化染色法检测海马神经元损伤及凋亡情况;剩余大鼠麻醉后取出双侧海马,采用Western blot法检测Omi/Htr A2、caspase9及HAX-1表达变化。结果1行为学观察:CON组SD大鼠无癫痫发作,PILO组、PILO+DMSO组、PILO+Ucf-101组大鼠出现不同形式的癫痫发作。各组大鼠癫痫成功率及发作潜伏期差异均无统计学意义(P>0.05)。2 HE染色结果:与CON组相比较,PILO 24h亚组、PILO+DMSO组、PILO+Ucf-101低剂量组和Ucf-101高剂量组海马神经元数目均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。PILO+DMSO组较PILO 24h亚组神经元数量减少,差异无统计学意义(P>0.05)。PILO+Ucf-101组海马神经元数目多于PILO 24h亚组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Ucf-101高剂量组海马神经元数目多于PILO+Ucf-101低剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3 Nissl染色结果:与CON组相比,PILO 24h亚组、PILO+DMSO组、PILO+Ucf-101低剂量组和Ucf-101高剂量组海马神经元数目减少(P<0.05)。PILO+DMSO组较PILO 24h亚组神经元数量减少,差异无统计学意义(P>0.05)。与PILO 24h亚组相比较,PILO+Ucf-101组海马神经元数目均增多(P<0.05)。PILO+Ucf-101高剂量组较PILO+Ucf-101低剂量组海马神经元数目增多(P<0.05)。4 TUNEL染色结果:PILO 24h亚组、PILO+DMSO组和PILO+Ucf-101组TUNEL阳性细胞多于CON组,有统计学差异(P<0.05);PILO+DMSO组较PILO 24h亚组阳性细胞数目增多,差异无统计学意义(P>0.05)。与PILO 24h亚组相比,PILO+Ucf-101组海马TUNEL阳性细胞数目减少,有统计学差异(P<0.05);与PILO+Ucf-101低剂量组比较,PILO+Ucf-101高剂量组海马TUNEL阳性细胞数目减少,有统计学差异(P<0.05)。5免疫组化染色结果:与CON组相比,PILO 24h亚组、PILO+DMSO组、PILO+Ucf-101组Omi/Htr A2、caspase9表达增高(P<0.05),与PILO 24h亚组相比,PILO+Ucf-101组Omi/Htr A2、caspase9表达减少(P<0.05),且PILO+Ucf-101低剂量组少于PILO+Ucf-101高剂量组(P<0.05)。与CON组相比,PILO 24h亚组、PILO+DMSO组HAX-1表达减少(P<0.05),与PILO 24h亚组相比,PILO+Ucf-101组HAX-1表达增多(P<0.05),且PILO+Ucf-101高剂量组较PILO+Ucf-101低剂量组表达增高(P<0.05)。PILO+DMSO组较PILO 24h亚组Omi/Htr A2、caspase9表达升高(P>0.05),HAX-1表达降低,差异均无统计学意义(P>0.05)。6 Western blot结果:与CON组相比,PILO组Omi/Htr A2、caspase9 2h开始升高(p<0.05),24h达高峰(P<0.05);HAX-1 2h开始升高(P<0.05),6小时达峰(P<0.05),然后下降,12h、24h均低于CON组(P<0.05)。与PILO 24h亚组比较,PILO+Ucf-101组Omi/Htr A2、caspase9表达降低(P<0.05),HAX-1升高(P<0.05);与PILO+Ucf-101低剂量组比较,PILO+Ucf-101高剂量组Omi/Htr A2、caspase9表达降低(P<0.05),HAX-1升高(P<0.05)。PILO+DMSO组较PILO24h亚组Omi/Htr A2、caspase9表达升高(P>0.05),HAX-1表达降低,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1癫痫发作后24h内Omi/Htr A2、caspase9表达持续增高,HAX-1表达早期增高,6h后降低,证实癫痫发作可诱发细胞凋亡。2 Ucf-101可减少致痫大鼠海马神经元凋亡,对癫痫后脑损伤具有保护作用,其机制与抑制Omi/Htr A2和caspase9表达,增加HAX-1表达相关。3 Ucf-101的神经保护作用具有剂量依赖性。