硫酸根、蛋氨酸和光照对GmCGS表达的影响及过表达β-Zein转基因大豆的创制

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大豆(Glycine max(L.)Merr.)是一种重要的经济作物,其蛋白质含量较高。作为人类和畜牧业重要的植物蛋白来源,大豆蛋白质中蛋氨酸等含硫氨基酸含量偏低,成为限制大豆营养品质的重要因素。已有研究获得蛋氨酸含量得到显著提高的大豆材料,但其提高程度有限,无法满足相应的营养需求。因此,创制出蛋氨酸含量更为显著提高的材料对于改善大豆营养品质,具有十分重要的意义。本研究从大豆胱硫醚-γ-合成酶编码基因GmCGS的表达特点以及创制并筛选蛋氨酸含量显著提高的转基因大豆株系两方面进行开展,以探究大豆蛋氨酸合成的规律,为基于蛋氨酸含量提高的大豆品质改良提供参考,创制出分别过表达外源蛋氨酸富含蛋白编码基因β-Zein和外源蛋氨酸合成通路关键酶编码基因AtDCGS的转基因株系,为后续获得同时表达两种基因的材料提供杂交亲本。以过表达AtDCGS的转基因大豆株系及其受体品种Jack为材料,在第三片复叶完全展开时(V4期)和鼓粒期(R6期),使用不同浓度硫酸根和蛋氨酸进行处理,在处理后一定时间内连续取样,检测样品中胱硫醚-γ-合成酶基因GmCGS表达的规律。结果表明,过表达AtDCGS转基因株系中,GmCGS表达量显著低于野生型材料Jack中该基因表达量,说明外源基因AtDCGS的导入抑制了内源基因GmCGS的表达。较高浓度硫酸根处理后野生型材料中该基因表达量显著升高,转基因材料中该基因表达量显著降低。蛋氨酸处理之后,对GmGCS的表达没有显著影响。将大豆品种Jack种植在不同的光照条件(12 h光照/12 h黑暗、0h光照/24 h黑暗)下,检测GmCGS的表达特点。研究发现,生长在黑暗条件下的材料,GmCGS表达量一直处于较低的水平,当有光照出现时,该基因的表达量迅速升高,在光照后2小时达到最大值,之后即使光照继续存在,其表达量也会持续下降。说明光照对于GmCGS的表达具有促进作用,但这种作用并没有持续性。构建组成型表达和种子特异型表达β-Zein植物表达载体,以大豆品种Jack为受体,转化获得转基因植株,对材料进行加代,期间进行草丁膦抗性筛选。已收获T3代转基因株系,其中组成型表达β-Zein的材料共收获65个株系,来自10株不同的T0代植株,种子特异型表达β-Zein的材料共收获84个株系,来自11株不同的T0代植株。进行PCR、RT-PCR检测,并测定氨基酸含量,目前已筛选获得蛋氨酸含量得到显著提高的株系,其蛋氨酸含量比野生型材料Jack提高14.8%。实验室前期已获得过表达AtDCGS的转基因大豆株系,对材料进行加代,期间进行草甘膦抗性筛选,已获得T4代转基因材料,其中组成型表达AtDCGS材料获得26个株系,来自4株不同的T0代植株,种子特异型表达AtDCGS材料获得33个株系,来自13株不同的T0代植株。为后续通过杂交创制同时表达两种基因的材料提供了亲本。
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