性发育是哺乳动物性成熟并获得生殖能力的过程,受神经-内分泌系统的精密控制。Kiss1/Kiss1R组成性发育的门控系统,它们将机体内外的调控信号整合后输入GnRH神经元。从下丘脑分泌到垂体的GnRH是神经系统输出的调控个体性发育和生殖能力的终极信号。下丘脑-垂体-性腺轴的再次活化以及Gn RH脉冲式分泌是性发育启动的标志。近些年,随着物质生活水平的提升,性早熟已经成为发病率最高的儿童内分泌疾病。解析调控性发育的遗传机制,对于预防性早熟和治疗生殖相关疾病的意义重大。本研究关注由基因转录后调控因子micro RNAs参与Kiss1/Gnrh1基因介导的性发育调控机制。分别以这两个性发育关键基因为中心,本课题主要开展了以下两部分的研究工作。第一部分的主题是研究参与Kiss1基因表达调控的miRNAs。为了便于高效地从全基因组范围筛选参与Kiss1基因表达调控的miRNAs,我们构建了一个Kiss1基因表达双色荧光报告系统。我们使用CRISPS/Cas9基因编辑技术将绿色荧光蛋白的编码基因e GFP插入到Kiss1基因终止密码子上游,使之享用全套Kiss1基因表达调控元件,以绿色荧光强度表征Kiss1表达水平。为了增强系统的特异性和稳定性,我们还为系统引入了提供内参荧光信号的红色荧光蛋白编码基因td Tomato的表达元件。借助流式细胞术,我们建立了灵敏高效的Kiss1基因表达调控因子检测方法。为提高功能miRNAs的筛选效率,我们先用生物信息学算法对小鼠全基因组miRNA文库进行简化。结合下丘脑miRNAs表达数据以及Target Scan和miRBase数据库中miRNAs的注释信息,综合考虑miRNAs的表达水平、调控靶基因的能力以及进化保守性,逐步缩小用于实验筛选的miRNAs范围。经过双色荧光报告系统和分子生物学实验筛选后,我们发现了在体外抑制Kiss1基因表达,并且在性发育期间下丘脑中表达水平持续降低的miR-199-3p。因此,将miR-199-3p作为候选Kiss1表达调控因子对分子机制进行进一步研究。在进行miR-199-3p调控Kiss1表达和性发育的机制研究时,我们将介导调控作用的信号通路作为研究对象。我们发现miR-199-3p通过协同抑制4个位于p38 MAPK通路中的蛋白激酶,高效调控信号通路活性。p38 MAPK通路活性的降低直接导致Kiss1转录因子活性和Kiss1基因表达水平的下降。无论是抑制大鼠下丘脑p38 MAPK通路活性,还是在小鼠下丘脑弓形核区特异性过表达miR-199-3p,都会引起个体性发育延迟、血清促性腺激素水平下降以及性腺发育受阻。第二部分的主题是解析miR-29对Gnrh1基因表达的调控作用。分析性发育期间下丘脑miRNAs表达谱,我们发现了在不同性发育阶段差异表达的miR-29。有研究显示,miR-29与个体生殖能力有关。因此,我们将miR-29作为参与性发育调控的候选基因进行功能解析。miR-29家族有四个成员,家族成员之间潜在的功能冗余可能为其功能解析带来挑战。为解决这一难题,我们构建了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的多基因共敲除单质粒系统,并将其应用于构建敲除任意组合miR-29家族成员的细胞模型。我们发现在miR-29家族成员全部缺失的GT1-7细胞中,性发育重要基因Gnrh1的表达水平上升2-3倍。经过生物信息学算法预测和分子生物学实验验证,我们发现miR-29-3p的靶基因Tbx21介导了miR-29家族对Gnrh1的转录调控。作为Gnrh1的转录激活因子,TBX21既可以直接结合于Gnrh1基因启动子直接发挥调控作用,又可以通过促进Gnrh1另一个转录因子Dlx1的表达间接发挥作用。我们还观测了干扰性发育前雌性小鼠下丘脑miR-29-3p和Tbx21的表达水平对个体性发育的影响。研究发现,下丘脑定位注射miR-29-3p抑制剂导致小鼠性发育提前。下丘脑视前区特异性Tbx21过表达小鼠不仅在青春期的性发育进程提前,而且在成年期个体的动情周期、血清促性腺激素水平和生殖能力也受到不同程度的影响。综上所述,我们的研究解析了两种新型的miRNAs介导的性发育调控机制,进一步拓展了调控性发育的遗传网络。根据miRNAs调控靶基因的特性,我们还建立了两种功能研究策略:其一,针对miRNAs的多靶点性和微效性,我们将由多组分构成、高度动态化且具有剂量敏感性的信号通路作为研究对象,证实了miRNAs可以通过多靶点协同调控同一生命过程;其二,针对miRNA家族成员之间的功能冗余,我们建立了多基因共敲除方法,实现在家族成员全部缺失的条件下进行基因功能研究。这两种策略克服了miRNAs功能研究的困难,可为其他miRNAs功能研究提供参考。