论文部分内容阅读
为应对食品安全、饮用水污染及病原体感染等全球公共卫生事件,开发具有高灵敏、高准确性的快速检测方法,对于有效控制全球公共卫生风险具有重要的现实意义。基于辣根过氧化物酶（HRP）催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色的ELISA方法因具有特异性好,检测通量高,价格便宜等优势,已成为食品安全相关污染物快速、高通量筛选的首选方案。然而,传统以HRP催化TMB显色的快检方法,存在酶催化产物颜色单一、产物信号强度不高(TMB摩尔消光系数3.9×104 M-1 cm-1)、检测灵敏度偏低、无法实现裸眼检测等缺陷;此外,传统ELISA的免疫学反应大多基于半固相界面,存在反应效率不高、需要反复加样及洗板等操作过程,检测步骤相对繁琐。因此,如何提高快检方法的检测灵敏度,构建适合现场使用的新策略,成为当前亟需解决的问题。本研究拟以有机小分子化合物黄曲霉毒素（AFB1）、三磷酸腺苷（ATP）及无机钠离子（Na+）等为模式分析物,从提升样本前处理效率,优化信号输出灵敏度及构建均相快检体系的角度,建立了基于四种信号传导体系的快检新方法。在食品安全快检体系中,高效的前处理方法是保障后续检测方法成功及灵敏度的重要前提。磁性免疫亲和提取方法因具有操作简单、免疫动力学反应效率高、可用于复杂样本的直接提取等优点,被广泛用于各类样本中目标物的高效富集与净化。然而,传统的磁免疫亲和分离方法存在磁性微球（MB）上抗体载量低,抗体不可重复使用造成的制造成本过高等缺陷。针对以上问题,本研究通过在MB表面修饰聚丙烯羧酸分子刷（MB@PAA）,并进一步装载抗AFB1纳米抗体（anti-AFB1 Nb）,以此建立了一种新型的磁免疫亲和提取玉米样品中AFB1的新方法。在该方法中,首先通过可逆断裂链加成聚合方法在羟基化磁性微球（HMB）上连接大量聚丙烯羧酸分子刷,以此提高抗体的载量,达到提高免疫磁珠对AFB1的饱和吸附量;其次,以耐变性能力更强的Nb代替传统易变性的单克隆或多克隆抗体（m Ab/p Ab）,以提高免疫磁珠的重复使用次数,降低亲和纯化的使用成本。结果表明,在最佳条件下,MB@PAA对anti-AFB1 Nb的最大饱和偶联量为623±23μg mg-1,是传统羧基化磁性微球（CMB）的19倍;MB@PAA@Nb对AFB1的最大饱和吸附量为0.23 mg g-1,是传统MB@Nb的35倍。MB@PAA@Nb在重复富集提取AFB110次后,其对AFB1的识别活性未见显著降低（p>0.05）,表明MB@PAA@Nb的重复使用性能较好。此外,该免疫磁珠使用的可靠性和实用性进一步通过提取AFB1加标的玉米样品得到了验证。其次,为克服以TMB为代表的传统酶催化产物显色信号颜色单一、不适宜于裸眼检测的缺陷。本研究通过引入对p H敏感的有机染料溴钾酚紫（BCP）作为信号输出元件,以AFB1标记的葡萄糖氧化酶偶联物（GOx-AFB1）作为竞争抗原,通过GOx催化底物葡萄糖产酸介导溶液p H变化,建立了高灵敏直接竞争ELISA定量及定性检测玉米样品中的AFB1。在最优条件下,该方法裸眼定性检测AFB1的阻断值（检测限）为100 pg m L-1,在对70份AFB1加标的实际玉米样本裸眼检测中,无假阳性和假阴性结果,证明了该方法裸眼定性检测的可靠性。该方法定量检测AFB1线性范围为25-200 pg m L-1,半数抑制浓度(IC50)为66.72 pg m L-1,较常规ELISA提高10倍。加标实验结果表明,该方法具有较好的准确度、精密度以及重现性;特异性实验结果显示该方法与赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）等常见真菌毒素无交叉反应,具有较好的特异性;将该方法检测结果进一步与传统高效液相色谱（HPLC）方法结果进行对比,结果显示两种方法无显著性差异（p>0.05）,具有良好的相关性。随后,本研究还制备了高摩尔消光系数的金纳米棒（Au NR）,以GOx催化产生双氧水（H2O2）介导Au NR刻蚀为等离子共振信号输出,建立了高灵敏直接竞争等离子共振ELISA定性及定量检测玉米样品中的AFB1。在该方法中,通过抗原抗体反应引入GOx介导产生的H2O2经HRP辅助催化分解为羟自由基（·OH）,随后·OH将Au NR刻蚀成球状金纳米粒子（Au NS）,金纳米粒子溶液的颜色及等离子共振吸收峰均发生变化,从而实现对目标物的裸眼定性及仪器定量检测。在最优条件下,该方法的裸眼定性检测AFB1的阻断值（检测限）为12.5 pg m L-1,定量检测AFB1的线性范围为3.1-150 pg m L-1,IC50为22.3 pg m L-1,较传统ELISA提高了35倍。样品加标实验结果表明,该方法检测AFB1的回收率介于82%-115%,变异系数（CV）为2%-13%。与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法检测结果对比,两种方法检测结果无显著性差异（p>0.05）,表明所建立方法具有较好的准确度和精密度。此外,交叉实验结果显示该方法与粮食中其他常见真菌毒素OTA、ZEN等无交叉反应,表明该方法具有较好的特异性。本研究进一步以GOx介导铜纳米粒子（Cu NP）合成为荧光信号输出,建立了超灵敏直接竞争荧光ELISA定量检测玉米样品中的AFB1。样品中AFB1与竞争抗原GOx-AFB1竞争结合固定在酶标板上的anti-AFB1 m Ab,从而引入GOx产生的H2O2,经Fe2+辅助催化分解H2O2为·OH,·OH随后氧化ss DNA,导致合成的Cu NP数量减少。样品中AFB1浓度越高,引入的GOx越少,溶液中完整的模板ss DNA越多,Cu NP的合成产物越多,荧光强度越高;反之荧光强度越低。在最优条件下,该方法定量检测AFB1的线性范围为0.46-400 pg m L-1,IC50为6.13 pg m L-1,最低检测限（LOD）为0.15 pg m L-1,较传统ELISA低96倍和220倍。样品加标实验结果表明,该方法检测AFB1的回收率在96.67%-114.92%,CV在1.64%-17.97%。与LC-MS/MS方法检测结果对比,两种方法无显著性差异,表明所建立方法具有较好的准确度和精密度。此外,交叉实验结果显示该方法与其他常见真菌毒素OTA、ZEN等无交叉反应,表明该方法具有较好的特异性。为克服非均相的传统ELISA方法免疫反应效率不高及检测步骤冗长的缺陷,本研究进一步以功能核酸（适配体、脱氧核酸酶）调控规律成簇间隔重复短回文序列及其相关系统12a（CRISPR/Cas12a）的DNase活性,介导切割非特异性报告DNA（ss DNA-FQ）作为信号输出,建立了高灵敏检测ATP及Na+的均相荧光分析方法。首先将ATP适配体通过与Cas12a的激活DNA（activator）互补配对,以此阻止Cas12a向导RNA（cr RNA）对activator的识别,此时Cas12a的DNase活性被抑制;当ATP适配体识别ATP后,适配体结构发生转换,释放的activator能被Cas12a的cr RNA识别,从而激活Cas12a的DNase活性,Cas12a循环切割溶液中ss DNA-FQ,溶液产生荧光信号。在最优条件下,该方法能在室温条件下,50 min内完成对ATP的均相、快速、高灵敏检测,定量检测ATP的线性范围为0.78-25μM,LOD为0.21μM,检测灵敏度显著高于同样基于荧光信号输出的商业化ATP检测试剂盒（LOD≈1μM）。实际加标样品检测结果显示,该方法与生物发光试剂盒结果无显著性差异（P>0.05）,表明该方法可靠性较好。结合便携式荧光仪平台,通过采集酶催化反应速率代替采集终点荧光值,可将该反应的整体检测时间进一步缩短至15 min,使该方法可满足临床快速诊断的需求。此外,通过巧妙设计Na A43DNAzyme的底物链和酶链,CRISPR/Cas12a系统亦可用于血液样品中Na+检测,该方法定量检测Na+的线性范围为0.049-50 m M,LOD为0.10 m M,实际加标样品结果与商业化Na+选择电极的检测结果具有较好的一致性,表明CRISPR/Cas12a在分析检测领域具有普适性。