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目的:本课题主要研究人肝癌细胞中CT23的相互作用蛋白,并进一步探讨其相互作用蛋白对肝癌细胞恶性生物学行为的影响,为研究CT23的生物学功能提供有价值的线索,从而为肝癌的发生、发展机制和相应治疗措施进一步研究提供实验依据。方法:利用GV358载体构建CT23过表达慢病毒,体外转染慢病毒并培养CT23过表达肝癌细胞株Huh7、SMMC-7721,借助荧光定量PCR(RT-q PCR)和免疫印迹(WB)验证肝癌细胞中CT23的表达水平,构建稳定转染CT23过表达(LV-CT23)的肝癌Huh7、SMMC-7721细胞系。Huh7、SMMC-7721细胞株实验各分为3组:实验组(LV-CT23),阴性对照组(NC-LV)及空白对照(Blank)。应用琼脂糖珠试剂盒进行CT23蛋白复合物的免疫沉淀(IP)实验,利用SDS-PAGE凝胶电泳和WB对免疫沉淀结果验证,免疫沉淀的样品通过液相色谱(LC-MS)进行CT23蛋白复合物的分析。之后利用DAVID、STRING、GO、KEGG等数据库对质谱的数据进行相关分析,同时借用NCBI、GEPIA、TCGA等数据库对CT23相关的候选蛋白进行查阅。同样用GV358载体构建候选蛋白X过表达慢病毒,体外转染并培养CT23和候选蛋白X共同过表达Huh7、Hep3B细胞株,用WB验证CT23与X共同表达水平,构建Flag-CT23+His-X稳定转染的Huh7、Hep3B肝癌细胞系。Huh7和Hep3B细胞分为5组:实验组1(Flag-CT23+His-X)、实验组2(Flag-CT23)、实验组3(His-X)、阴性对照(NC-LV)及空白对照(Blank)。借助琼脂糖珠Protein A/G进行免疫共沉淀(CO-IP)实验,WB对CT23的相关候选蛋白进行检测验证。体外构建并培养候选蛋白X沉默肝癌细胞株Huh7、Hep3B,用CCK-8实验检测蛋白X沉默后肝癌细胞Huh7、Hep3B的增殖能力;用细胞划痕、transwell迁移实验检验X沉默之后Huh7、Hep3B细胞的迁移能力。结果:慢病毒转染细胞Huh7、SMMC-7721后,人的Huh7、SMMC-7721肝癌细胞中CT23 m RNA和蛋白表达水平显著上升,差异具有统计学意义(P<0.01)。琼脂糖珠免疫沉淀肝癌Huh7、SMMC-7721细胞中CT23蛋白复合物,Western Blot验证复合物成功下拉。CT23免疫沉淀样品质谱分析得到278种可能与CT23相互作用蛋白,经GO数据库富集分析,按照富集分数的不同得到22类与细胞组成、基因分子功能及生物过程相关的蛋白。其中最主要的是与细胞黏附相关蛋白,如LIMA1、PCBP1等,其次是与RNA剪切相关蛋白,如NCBP1,SNRPG等。利用在线工具STRING、Cytoscape软件进行278种可能相互作用蛋白的互作分析,筛选出NCBP1、EIF4A3、RPSA等10种核心相互作用蛋白。通过查阅KEGG数据库和大量的文献发现NCBP1能够参与未成熟RNA的加工、细胞核中的成熟的m RNA向细胞质的转运,突变引起的异常GLE1对m RNA的核输出,并且还能够介导RNA无意义的衰变,是细胞生长不可或缺的因子。因此本课题组选择NCBP1作为CT23候选结合蛋白进一步研究。转染CT23和NCBP1共同过表达慢病毒的人肝癌Huh7、Hep3B细胞,肝癌细胞Huh7和Hep3B中CT23和NCBP1蛋白水平的表达均上升。Western Blot验证免疫共沉淀(CO-IP)样品,发现NCBP1可能是CT23的相互作用蛋白。肝癌细胞Huh7、Hep3B通过NCBP1沉默慢病毒转染之后,肝癌细胞Hep3B中NCBP1-RNAi88处理组NCBP1 m RNA和蛋白水平的表达显著下降,同时CT23 m RNA和蛋白表达水平也出现显著下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.01);Huh7细胞中NCBP1-RNAi88组NCBP1 m RNA水平的表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时CT23的m RNA表达水平无显著性变化。细胞CCK-8增殖实验结果表明,细胞Huh7、Hep3B中实验组NCBP1-RANi88生长速率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);transwell迁移实验结果表明,相较NC-LV组和空白对照组而言,肝癌细胞Huh7、Hep3 B各自处理组的穿孔细胞数明显缩少,有统计学差异(P<0.01);细胞划痕实验显示,Huh7、Hep3B细胞中NCBP1-RNAi88实验组的愈合率明显小于对照组,差异有统计学意义。结论:已成功构建CT23过表达肝癌细胞系Huh7、SMMC-7721,通过免疫沉淀、质谱分析,得到可能与CT23相互作用的278种遴选蛋白;成功构建CT23与NCBP1共同过表达肝癌Huh7、Hep3B细胞系,CO-IP以及Western Blot验证NCBP1可能是CT23相互作用蛋白;NCBP1沉默的肝癌Huh7、Hep3B细胞系构建成功,沉默NCBP1对肝癌细胞Huh7、Hep3B增殖以及迁移具有显著的抑制作用。