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乳腺癌的新发病例位居女性肿瘤发病率之首。随着乳腺癌早期诊断以及治疗技术的飞速发展,大多数乳腺癌患者得到有效治疗,但是仍有部分恶性乳腺癌患者,尤其是高转移性的三阴性乳腺癌患者,由于癌细胞靶点不明或机体缺少特异性受体而难以得到有效治疗,甚至出现药物耐受而导致治疗失败。因此亟需进一步解析癌细胞转移机制,寻找新的药物靶点以提升乳腺癌临床治疗效果。信号诱导增殖相关蛋白1（Signal-induced proliferation associated Protein1,SIPA1）,是小G蛋白家族成员之一,能促进细胞内Rap1GTP水解,发挥Rap GAP活性。前期研究发现SIPA1蛋白在不同的肿瘤细胞中有不同的核质分布,且与多种肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等的增殖、转移相关。高转移性的三阴性乳腺癌组织和细胞中,SIPA1蛋白高表达并且呈现细胞核分布,乳腺癌细胞中SIPA1蛋白的核定位与乳腺癌的高转移性存在相关性,那么SIPA1这一130 k Da的蛋白是如何进入细胞核的?本论文首先将SIPA1蛋白序列与数据库中已报道的经典核定位信号序列进行比对,未发现SIPA1存在已知核定位信号。那么SIPA1蛋白中是否存在新的核定位信号?本论文构建了多个SIPA1蛋白缺失突变体并采用核质分离、免疫印迹、免疫荧光、共聚焦显微成像等技术检测其突变体核质定位,发现SIPA1蛋白N端核定位区域NLR（Nuclear Localization Region）（140-179aa）结构序列是决定SIPA1蛋白在细胞中核质分布的关键区域。进一步研究表明此肽段能够引导已知定位于细胞质的GFP-GFP（2×GFP）蛋白定位于细胞核中。对NLR肽段进行精细结构分析,此肽段三级结构是首尾两个β折叠,中间由无规则卷曲相连的。此SIPA1-NLR（140-179aa）特殊空间结构可能介导SIPA1蛋白核定位。细胞内的核转运蛋白识别货物蛋白上的NLS（Nuclear Localization Signal）后,转运货物蛋白进入细胞核。为了探究细胞内识别SIPA1-NLR的核转运蛋白,本论文分析了前期免疫共沉淀、质谱实验结果,发现在MDA-MB-231细胞中SIPA1蛋白可能与核转运蛋白Importin7、Importinβ1结合。为了进一步确定与SIPA1结合的核转运蛋白,本论文构建了SIPA1-NLR原核表达质粒,采用原核表达外源蛋白及纯化体系获得带有GST标签的NLR蛋白。免疫共沉淀实验检测到SIPA1-NLR与核转运蛋白Importin7结合。此结果表明SIPA1-NLR可能是通过与核转运蛋白Importin 7结合,实现SIPA1蛋白由细胞质向细胞核的转运。为了明确细胞中核、质定位的SIPA1蛋白所发挥的功能,本论文中构建了稳定过表达SIPA1全长或SIPA1-ΔNLR蛋白的乳腺癌MCF7细胞系MCF7/SIPA1和MCF7/SIPA1-ΔNLR。研究发现过表达SIPA1全长的MCF7/SIPA1细胞的迁移能力较MCF7细胞显著提高;而过表达缺失NLR肽段的SIPA1蛋白的MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞的迁移能力与MCF7细胞的迁移能力相比无显著性变化。此结果表明SIPA1-NLR结构域能够改变SIPA1蛋白促乳腺癌细胞迁移的能力。前期研究发现过表达SIPA1蛋白能够导致原本对化疗药物表阿霉素敏感的MCF7细胞变得不敏感。本论文中使用表阿霉素处理多种乳腺癌细胞,发现乳腺癌细胞中SIPA1蛋白的表达水平及其核质分布与该细胞对表阿霉素的敏感性直接相关。SIPA1高表达且核定位的BT549细胞对表阿霉素表现为不敏感;SIPA1低表达的MCF7细胞对表阿霉素处理表现为敏感。本论文中使用表阿霉素分别处理MCF7/SIPA1和MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞后,MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞与MCF7/SIPA1细胞相比对表阿霉素变得敏感。核定位的SIPA1蛋白是如何改变乳腺癌细胞的药物敏感性?前期研究结果显示,高表达SIPA1的MDA-MB-231细胞经表阿霉素处理后,细胞中多种耐药基因如ABCB1、ABCG2的mRNA表达水平比SIPA1敲低的MDA-MB-231/sh-sipa1细胞中相应的基因表达水平显著升高。本论文检测了MCF7/SIPA1和MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞中上述耐药基因的mRNA表达水平,同样发现MCF7/SIPA1细胞中的多药耐药基因ABCB1的mRNA表达水平与MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞中ABCB1的mRNA表达水平相比显著升高;而MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞中ABCB1的mRNA表达水平与MCF7细胞中的ABCB1的mRNA表达水平相比无显著差异,且均较低。上述结果表明SIPA1蛋白的NLR结构域不仅能介导SIPA1蛋白核定位,而且SIPA1蛋白入核后能作用于ABCB1基因,上调ABCB1基因的mRNA表达水平,导致高表达SIPA1的乳腺癌细胞对表阿霉素的化疗药物不敏感。综上所述,本论文发现SIPA1蛋白N端140-179aa结构域能引导SIPA1蛋白入核,并且确定了此结构域为一个不同于经典核定位信号的新核定位区域。在此基础上进一步揭示了SIPA1蛋白可能通过此结构域与核转运蛋白Importin7结合、入核后,调控乳腺癌细胞中多药耐药基因ABCB1的mRNA表达水平,降低乳腺癌细胞对表阿霉素的敏感性,为恶性肿瘤的有效治疗提供可能的靶向位点。