目的通过分子和细胞生物学手段研究新的脆性位点基因FATS调控p53表达的分子机制,包括FATS与p53蛋白之间的相互作用、DNA损伤信号转导中FATS对p53蛋白的共价修饰、转录活性及蛋白稳定性的影响,进一步确定FATS的抑癌基因性质,揭示FATS基因表达与p53功能之间的正反馈调节关系。方法1.用FATS表达载体转染细胞,24小时后提取细胞总蛋白或总RNA。用Western blot实验检测细胞中p53蛋白的表达量；进行RT-PCR实验检测细胞中p53mRNA表达水平,分析FATS对p53表达的影响。2.用FATS表达载体或FATS-shRNA转染细胞后,用蛋白合成抑制剂Cycloheximide（CHX）或DNA损伤化学诱导剂Etoposide处理细胞,Western blot检测细胞中p53蛋白的表达量,分析FATS对p53蛋白的稳定性及DNA损伤后FATS对p53蛋白磷酸化和乙酰化修饰的影响。3. FATS表达载体单独或与p53表达载体共转细胞后,免疫共沉淀（IP）法检测FATS蛋白与p53蛋白的细胞内相互作用。4.用FATS原核表达载体GST-FATS（1-363）转化大肠杆菌BL21, IPTG诱导,纯化GST-FATS（1-363）蛋白,用于蛋白质相互作用研究。5.利用体外转录和体外翻译偶联系统（TNT, Promega试剂盒）从p53表达载体直接得到纯化的p53蛋白。6.用纯化的GST-FATS （1-363）蛋白与p53蛋白进行体外蛋白结合（GST-pull-down）实验,研究FATS蛋白N-端与p53蛋白是否发生直接的相互作用。7.用染色质免疫沉淀的方法检测FATS对MEF （p53野生型）细胞中p53结合p21启动子的影响。8.用受控于p21基因启动子的荧光酶报告基因载体pGL2-p21-luc与p53、FATS表达载体单独或共转H1299（p53表达沉默）细胞,用荧光酶报告基因分析试剂盒和荧光酶活性检测仪检测样品中荧光酶活性,进一步分析FATS对p53转录因子活性的影响。结果1.与对照组细胞相比较,FATS过表达使细胞中p53蛋白的表达水平明显升高;用FATS-shRNA抑制细胞内源FATS表达之后,细胞中p53蛋白的表达量明显降低。2. FATS表达对p53mRNA表达水平没有影响。3.用蛋白合成抑制剂Cycloheximide （CHX）处理细胞后,FATS表达能显著抑制细胞内p53蛋白的降解。4.免疫共沉淀和GST pull-down结果显示FATS蛋白能与p53蛋白在体内和体外发生相互作用,FATS蛋白N端（1-363）区域直接与p53蛋白结合。5.DNA损伤后,FATS能进一步上调p53蛋白的表达量,并且增强p53蛋白的乙酰化和磷酸化水平。6. FATS表达能显著提高p53下游靶基因p21的mRNA表达水平,并促进p53与p21启动子的结合；荧光酶报告基因检测结果显示FATS本身没有转录因子活性,其对p21转录水平的调节是p53依赖性的。结论1. FATS通过增加p53稳定性而诱导p53表达。2. FATS是一个p53蛋白结合蛋白,通过其N-端与p53蛋白发生直接相互作用。3. FATS促进DNA损伤后p53的激活,包括进一步增强p53蛋白稳定性和其磷酸化、乙酰化修饰。4. FATS上调p53蛋白的转录因子活性,是p53-p21信号通路的强有力正调控因子。