【摘 要】
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目的:探索CALM1与EGFR的联合抑制作用对食管癌侵袭转移的影响,揭示CALM1与EGFR的协同抑制作用对食管癌恶性表型的作用机制。方法:(1)临床表型的关联性:使用免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC)检测84例食管鳞癌组织和对应癌旁组织中CALM1和EGFR的表达,分析CALM1和EGFR与临床病理参数的相关性。(2)细胞水平的功能:在3种食管鳞癌细胞系中用实时荧光定
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目的:探索CALM1与EGFR的联合抑制作用对食管癌侵袭转移的影响,揭示CALM1与EGFR的协同抑制作用对食管癌恶性表型的作用机制。方法:(1)临床表型的关联性:使用免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC)检测84例食管鳞癌组织和对应癌旁组织中CALM1和EGFR的表达,分析CALM1和EGFR与临床病理参数的相关性。(2)细胞水平的功能:在3种食管鳞癌细胞系中用实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测CALM1和EGFR的本底表达,运用CRISPR-Cas9技术,在CALM1和EGFR相对高表达的KYSE150、Eca109食管鳞癌细胞系敲除CALM1。运用q RT-PCR检测转染后CALM1的表达量。运用MTT实验检测敲除CALM1后,协同使用EGFR抑制剂(阿法替尼)对食管鳞癌细胞增殖的影响。Transwell实验和细胞划痕实验检测敲除CALM1后,协同使用EGFR抑制剂对细胞侵袭和迁移的影响。流式细胞术检测对细胞凋亡率和细胞周期的影响。运用Western blot检测EMT相关分子的表达。(3)动物模型方面:通过裸鼠成瘤实验,确定CALM1敲除和EGFR靶向干预的协同机制。结果:(1)临床表型的关联性:免疫组化结果显示,CALM1和EGFR在食管癌组织的表达量与癌旁组织相比明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,CALM1和EGFR在食管鳞癌组织的表达具有相关性。临床病理参数分析表明,CALM1和EGFR高表达患者与病理分级具有统计学意义(P<0.05)。对CALM1和EGFR的表达情况进行Kaplan-Meier生存分析,发现两者同时高表达组患者预后不良。(2)细胞水平的功能:基于q RT-PCR结果显示,在食管鳞癌细胞系中敲除CALM1后,联合使用EGFR抑制剂,显示:细胞增殖、迁移和侵袭均受到明显抑制(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G1期,细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。Western blot显示EMT相关分子如FN1、β-catenin、Twist表达降低。(3)动物模型方面:裸鼠成瘤实验显示敲除CALM1协同使用EGFR抑制剂后肿瘤重量和总荧光明显降低(P<0.05)。结论:本研究结果表明敲除CALM1联合使用EGFR抑制剂,通过协同作用抑制EMT途径参与调控食管癌的恶性表型。CALM1可能克服EGFR抑制剂(阿法替尼)的耐药性,有望成为治疗肿瘤的新靶点。
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