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背景和目的Mdm2(Murine double minute 2)称为鼠科双微体,最初是在小鼠成纤维细胞的染色体研究中发现的一个癌基因。MDM2蛋白是抑癌因子p53的负调控因子,具有泛素连接酶活性,通过与p53的结合,抑制p53转录活性,转位出核,以及促进p53泛素化修饰并被蛋白酶体所降解。在结直肠癌细胞中报道低氧下MDM2基因表达显著降低而p53表达升高,在转化细胞系中亦有报道MDM2低氧下表达降低,提示MDM2基因与低氧环境的作用。高原鼢鼠(Myospalax baileyi,M.baileyi)生活在青藏高原(平均海拔3300 m,14%02)草甸的低氧和寒冷的环境中,常年地下洞道生活;甘肃鼢鼠(Myospalax cansus,Mcansus)主要分布在我国陕西黄土高原(平均海拔600 m,19.7%O2),地下洞穴生活。曾有报道高原鼢鼠所处的洞穴中,氧含量较低,C02含量较高并且随季节,岩层类型,雨水多少及洞穴深度大小而发生变化。高原鼢鼠动脉中的氧分压是SD大鼠的1.5倍,而静脉中的氧分压是SD大鼠的0.26倍;同时,高原鼢鼠动脉中CO2分压是SD大鼠的1.5倍。之前本实验室在研究以色列盲鼹鼠Sgalili时发现,同样在洞穴生活的动物,以色列盲鼹鼠通过自身p53基因的表达适应不同浓度的低氧环境,同时发现p53启动子甲基化差异对盲鼹鼠S.galili适应不同生境,物种分化具有重要影响。在长期的环境适应过程中,高原鼢鼠和甘肃鼢鼠可能形成了各自特殊的不同生理功能。我们实验室报道青藏高原的小哺乳动物,如高原鼠兔、高原鼢鼠和根田鼠具有各自不同的低氧多模式化适应机制,本论文主要是比较研究高原鼢鼠和甘肃鼢鼠的MDM2及其相关基因的表达变化,Apaf1(Apoptotic protease activating factor 1)和 p21 在 MDM2-p53 相互作用中的转录活性。我们进一步比较了两种动物p53启动子的甲基化变化,探讨MDM2和环境适应的分子调节机制。实验设计和方法获得甘肃鼢鼠MDM2序列,分析已有的高原鼢鼠与甘肃鼢鼠的MDM2序列差异。动物整体水平:研究高原鼢鼠和甘肃鼢鼠MDM2及其相关靶基因的组织表达特异性,进一步模拟低氧(7000m,8%O2)环境,研究实验室SD大鼠在低氧应激下的MDM2及其相关基因的组织表达特异性。细胞水平:将人类(Homo Sapiens)、草原田鼠(Microtus ochrogaster,M.och)、高原鼢鼠、甘肃鼢鼠和根田鼠(Microtus oeconmus,Mo)MDM2表达质粒与人类的p53表达质粒共转入人类非小细胞肺癌细胞NCI-H1299(p53缺失细胞系),分别进一步暴露于低氧(1%O2)及高C02环境(pH=6.4)后,利用双荧光素酶活性检测,研究MDM2对p53靶基因的转录激活或抑制作用。比较了高原鼢鼠和甘肃鼢鼠的p53启动子的甲基化水平,预测分析了可能的转录因子和调控结合位点。实验结果1.甘肃鼢鼠(Myospalax Cansus,GenBank:KR149456.1)MDM2 基因 CDS 区长度为1461 bp,所编码的蛋白质由487个氨基酸残基组成。用Clustal W分析表明甘肃鼢鼠MDM2与高原鼢鼠MDM2的氨基酸同源性为99.38%,进化树分析显示两者处于同一分支。高原鼢鼠和甘肃鼢鼠分别与大鼠MDM2氨基酸序列比较,同源性为81.6%和82%。甘肃鼢鼠MDM2氨基酸在131位是丝氨酸(Gly 131 Ser)的突变(高原鼢鼠和大鼠的氨基酸序列131位均为Gly)。2.高原鼢鼠脾脏中的MDM2基因表达水平高于甘肃鼢鼠中的表达水平;在肝脏和脾脏中p53基因表达水平高于甘肃鼢鼠的,而在脑中,p53的表达水平却明显低于甘肃鼢鼠的;高原鼢鼠肝脏、脾脏和肺脏中的p21表达水平高于甘肃鼢鼠,而在脑中p21的表达水平比甘肃鼢鼠低;高原鼢鼠肝脏和肺中puma的表达水平明显低于甘肃鼢鼠的。3.实验室SD大鼠低氧应激8小时后,脾脏中的MDM2表达水平明显升高,而大脑前额叶皮层中的MDM2基因表达水平无明显变化。SD大鼠的肝脏,脾脏和肺中,低氧下p53表达水平降低,而大脑前额叶皮层p53基因表达水平无明显变化。4.双荧光素酶报告基因的检测结果显示:常氧条件下,高原鼢鼠的MDM2对Apaf1和p21的转录活性高于甘肃鼢鼠的MDM2的转录活性;低氧(1%02,8 h)条件下,甘肃鼢鼠的MDM2-p53共转对Apaf1的转录活性高于高原鼢鼠。而高C02(pH=6.4)条件下,高原鼢鼠MDM2-p53相互作用对Apaf1的转录高于甘肃鼢鼠。5.利用MethPrimer软件预测分析高原鼢鼠p53和甘肃鼢鼠p53基因调控区的CpG岛。结果显示,高原鼢鼠p53上游调控区2000bp范围内有4个CpG岛,长度分别为100,135,358和105 bp。甘肃鼢鼠p53上游调控区1959bp范围内有2个CpG岛,长度分别为504 bp和108 bp。两者相比,高原鼢鼠的CpG岛更加分散,位置也更偏向转录起始位点+1。甲基化检测-1487～-1181 bp范围显示,高原鼢鼠肺脏组织中p53启动子区甲基化水平高于甘肃鼢鼠,检测到17个甲基化位点,其中10个位点存在显著差异。进一步利用PROMO软件预测的转录因子有40种,其中33种是相同的。其中COE1,CP2,AP-2和Yi等转录因子结合在1号(相对于高原盼鼠的-1448 bp)和2号(-1446bp)的甲基化位点上。小结高原鼢鼠和甘肃鼢鼠MDM2高度保守。甘肃鼢鼠在CDS区序列上存在131位G131S的变异。高原鼢鼠和甘肃鼢鼠MDM2,p53及其靶基因表达具有组织特异性。低氧上调了大鼠脾脏中MDM2表达。细胞实验结果显示,在高C02下高原鼢鼠MDM2-p53对Apaf1的转录高于甘肃鼢鼠,同时低氧下,高原鼢鼠MDM2通过p53调节Apaf1的转录低于甘肃鼢鼠,提示高原鼢鼠MDM2在低氧和高C02适应中的重要性。Apaf1是p53诱导的凋亡上调基因,提示高原鼢鼠MDM2在低氧和高C02环境适应中通过Apaf1上调来调控细胞命运。高原鼢鼠p53启动子的甲基化水平高于甘肃鼢鼠,p53启动子的甲基化变化可能影响了 p53和MDM2转录调节,提示两种动物适应特殊低氧和高C02环境的MDM2-p53转录的不同调节。