桑黄(Sanghuangporus baumii)是一类珍稀药用真菌,具有抗肿瘤、增强机体免疫力、治疗炎症、抗衰老、降血糖、保护肝脏及修复损伤等药用价值。研究表明,桑黄中有效的药物成分主要是多糖、黄酮、吡喃酮类、甾体及三萜类化合物等。肿瘤是严重威胁人类生命的疾病,也是人类至今尚未攻克的疾病之一。目前,具有抗肿瘤活性的药用真菌的开发利用成为人们寻找抗肿瘤新药的方向之一,也是国内外学者的研究热点。本文从桑黄(S.baumii)中分离纯化出桑黄总三萜,并研究了其对人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞Caco-2、人宫颈癌细胞Hela这4种肿瘤细胞的抗肿瘤作用及其机制,旨在为从药用真菌中筛选抗肿瘤药物,及研究药用真菌抗肿瘤的作用机制提供一定的数据与基础。本文的主要研究内容与结果如下:1、研究超声辅助法提取桑黄总三萜的最佳工艺。用响应面法对超声辅助提取桑黄总三萜的工艺条件进行优化,获得的最佳提取工艺为:乙醇浓度70%,超声温度60℃,超声时间40min,液固比为20:1,超声功率240W,桑黄总三萜的得率为9.83 mg/g。2、研究大孔吸附树脂纯化桑黄总三萜的纯化工艺。分别选用不同类型的大孔吸附树脂(HPD-100、AB-8、X-5和D-101),通过静态吸附和解吸附试验确定桑黄总三萜的最优纯化条件为:大孔树脂:D101大孔树脂;吸附条件:上样液pH值为6.0,上样液浓度为1.0mg/mL,上样流速为3BV/h,上样体积为4BV;洗脱条件:依次用蒸馏水3BV、20%乙醇溶液2BV、70%乙醇溶液4BV进行洗脱,流速为3BV/h,收集70%乙醇的洗脱液。纯化后的桑黄总三萜纯度为22.49%,比纯化前桑黄总三萜的纯度提高了近5倍。3、通过MTT法、CASY细胞分析和流式细胞分析等技术检测桑黄总三萜对MCF-7、A549、Caco-2和Hela4种肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果表明,桑黄总三萜对Hela细胞和Caco-2细胞增殖有显著抑制作用,其最小抑制浓度为0.2mg/mL;对MCF-7细胞和A549细胞增殖有显著抑制作用,其最小抑制浓度为0.3mg/mL;桑黄总三萜对4种肿瘤细胞的最佳作用时间均为48h;随着桑黄总三萜浓度的加大,其对这4种肿瘤细胞增殖的抑制作用越强。4、应用光学显微镜、激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜,观察桑黄总三萜对4种肿瘤细胞形态的影响。结果表明,添加桑黄总三萜处理后的肿瘤细胞均生长异常,细胞形态不规则,呈分枝状、纤维状,细胞间常见白色亮点;细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象的空泡结构,部分染色质出现浓缩状态,染色质高度凝聚、边缘化,有的细胞中还可见凋亡小体状空泡;细胞核呈波纹状或呈折缝样,并有.些凋亡小体产生;应用磷脂酰丝氨酸外翻分析和线粒体膜电位分析,检测桑黄总三萜对4种肿瘤细胞细胞膜外翻和线粒体膜电位的影响。结果表明,添加桑黄总三萜能促进这4种肿瘤细胞的磷酯酰丝氨酸外翻,降低线粒体膜的电位;通过DNA片段化检测桑黄总三萜对4种肿瘤细胞DNA完整性的影响。结果表明,添加桑黄总三萜能显著破坏肿瘤细胞DNA的完整性。综合以上结果说明,桑黄总三萜能明显促进这4种肿瘤细胞凋亡。5、应用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、蛋白质免疫共沉淀和蛋白质亚细胞定位等技术,检测桑黄总三萜对4种肿瘤细胞线粒体凋亡途径和内质网介导的凋亡途径相关蛋白的表达、定位及相互作用的影响。结果表明,添加桑黄总三萜能显著促进线粒体凋亡途径相关的促凋亡基因p53、Bax、Cytc、Apaf-1、caspase-3和caspase-9的表达,抑制抗凋亡的基因Bcl-2的表达,并促进Cytc蛋白从线粒体双层膜中释放到胞浆,与Apaf-1结合,形成Apaf-1-Cytc-Caspase-9凋亡复合体,激活caspase-3,从而诱导肿瘤细胞凋亡;同时,结果还表明,添加桑黄总三萜也能显著促进内质网介导的凋亡途径相关基因 Grp78、Ire1-α、TRAF-2 和 caspase-12 的表达,促进 Ire1-α 与 Grp78 分离,然后与TRAF-2结合,激活TRAF-2,然后使TRAF-2大量召集Caspase-12,从而形成凋亡复合体,诱导肿瘤细胞凋亡。综上所述,桑黄总三萜能同时通过激活线粒体凋亡途径和内质网介导的凋亡途径诱导这4种肿瘤细胞的凋亡。