猪链球菌(Streptococcus suis, suis)是引起猪链球菌病的主要病原菌,给世界养殖业造成巨大的损失,其中血清型2型作为一种重要人畜共患病原菌,还严重威胁着人类健康。目前,猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, S.suis 2)被认为是越南第一大,台湾第二大,泰国第三大致成人细菌性脑膜炎的主要病原菌。尽管猪链球菌2型在全球已收引起高度关注,国内外很多学者发掘鉴定了S. suis 2多种毒力因子,对致病机理也进行了一定程度的研究,但目前对S. suis 2致病与免疫机制仍然没有完全阐明清楚,主要原因可能是仍然还有许多未经鉴定的新毒力因子在其中发挥重要作用。因此,发掘、鉴定新的毒力因子,阐明其致病与免疫机制,将为进一步研制出安全、高效的疫苗奠定基础,从而最终有效的控制猪链球菌2型病在我国发生和流行。猪链球菌2型能逃避宿主天然免疫杀伤,并刺激机体产生炎症风暴,最终引起败血症、脑膜炎及中毒性休克综合征等典型症状。寻找并解释能诱导机体产生急性炎症的基因或蛋白将是解释S.suis 2诱发中毒性休克综合症的分子基础。本课题组在前期通过构建双组份调控系统ResS/ResR基因缺失突变株并进行基因芯片扫描,结果表明SsPepO和SsPspC两个基因分别下调44倍和10.5倍,并通过荧光定量PCR验证。通过对其氨基酸序列进行BLAST比较分析,发现SsPepO和SsPspC与肺炎链球菌中的PepO和PspC相似性分别为62%和43%。大量研究已经证实肺炎链球菌PepO和PspC在逃避宿主天然免疫中扮演重要的角色。前期本课题组研究结果也证实,缺失猪链球菌2型SsPepO后,通过仔猪模型表明单基因缺失突变株ΔSsPepO毒力显著下降,但毒力降低的机制并不清楚。鉴于以上研究背景,我们推测SsPepO和SsPspC在参与S.suis 2引起宿主急性炎症中扮演重要的作用色。为了阐明S.suis 2诱导机体产生急性炎症暴的机制,本研究以S.suis 2高致病株SC19为亲本株,以SsPepO和SsPspC为研究对象,首先构建了单基因缺失突变株ΔSsPspC,并在单基因缺失突变株ΔSsPepO基础上进一步构建双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC,分析了SsPepO和SsPspC的缺失对猪链球菌2型基本生物学特性的影响。进一步通过以小鼠模型,评价基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC的致病性以及炎症因子表达的影响。最后,分别以小鼠和仔猪为模型评价了双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC的安全性和免疫效力。主要研究内容包括：1.温敏型自杀性重组质粒的构建以猪链球菌2型高毒力菌株(SC19菌株)基因DNA为模板,通过PCR分别扩增SsPspC编码基因的上下游片段,依次克隆到温敏型自杀性质粒pSET4s上,构建基因缺失突变株ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC所需要的重组质粒。2.基因缺失突变株ΔSsPspC、ΔSsPepO/ΔSsPspC的筛选与鉴定将重组质粒分别电转化SC19菌株和单基因缺失突变株ΔSsPepO感受态细胞,通过PCR进行筛选,进一步利用RT-PCR、测序等方法验证,成功构建单基因缺失突变株ΔSsPspC和双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC。3.基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC和ΔSsPepOl/ΔSsPspC生物学特性及对小鼠致病性研究在同等条件下,将基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC与野生株WT比较,观察基本生物学形状的变化。结果表明现,基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC在TSB培养基中能够稳定生长传代,突变株的菌落形态、电镜结构、溶血能力没有发生明显的变化。以Balb/c小鼠为模型,测定了基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC的半数致死量(LD5o),结果显示,SsPepO和SsPspC单基因缺失后,突变株ΔSsPepO和ΔSsPspC的毒力降低,但并不显著,而双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC的毒力下降较为明显。根据LD5o结果,将三个突变株使用5×108CFU相同剂量分别感染小鼠。结果表明基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC感染小鼠发病率降低,其中双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC感染小鼠的存活率为50%。表明同时缺失SsPepO和SsPspC基因后S.suis 2的致病力显著下降。为进一步深入研究SsPepO和SsPspC参与诱导急性炎症,以1×108CFU剂量的基因缺失突变株ΔSsPepO、ΔSsPspC、ΔSsPepO/ΔSsPspC和SC19菌株分别感染小鼠,在3h、6h、9h、12h采血、分离血清后检测MCP-1、 IL-8、IL-6、TNF-α、IL-1β主要炎症因子的表达情况,分析差异表达显著的炎症因子,结果显示,基因缺失突变株ΔSsPspC和ΔSsPepO/ΔSsPspC引起的炎症因子MCP-1与SC19菌株相比在9h差异显著(P<0.05),IL-8在3h的差异极显著(P<0.01),而其他炎症因子表达并没有明显差异,这些结果将为后续深入研究SsPepO和SsPspC参与S.suis 2诱导急性炎症,产生中毒性休克综合症奠定基础。4.双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC对小鼠的免疫效力试验将双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC并以1×108CFU剂量对6周龄Balb/c小鼠进行免疫,在二免后第14天采血进行抗体检测。结果表明,双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC突变株产生的抗体水平达到1：40960,主要以IgG2a亚类为主。淋巴细胞增殖试验结果显示,双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC免疫组的脾细胞经ConA刺激72h后,与阴性对照组和空白组相比,显著增殖(P<0.001)。ConA刺激的脾细胞在72h,细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平也明显高于未刺激组,但IL-4的表达量很低,说明双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC产生的免疫反应主要以Th1型免疫反应为主。全血杀菌试验结果显示,突变株免疫组杀菌率达到52%。最后,以猪链球菌2型(SC19)1.29×109CFU的剂量进行攻毒,免疫组的保护率达到90%。被动免疫结果显示,免疫组保护率达到87.5%。攻毒以后,免疫组小鼠的肺和脑组织没有病理损伤,表明构建的双基因缺失突变株对小鼠是安全的,能够抵抗猪链球菌2型强毒株攻击。5.双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC对仔猪的安全性和免疫效力研究将双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC分别以2×108CFU和4×108CFU剂量感染4周龄仔猪,进行安全性试验,每天记录体温变化、食欲。精神状况等情况。结果表明,感染一周内体温最高上升1℃左右,而后迅速恢复正常水平,精神和采食均正常,表明突变株是安全的。以4×108CFU的免疫剂量通过肌肉注射途径免疫4周龄仔猪,一周后能从血液中检测到抗体,14天加强免疫后,机体能产生较高水平的抗体,主要以IgG2a为主。全血杀菌试验结果证实,ΔSsPepO/ΔSsPspC产生的特异性抗体能够起到杀菌和调理吞噬作用。二免后14天,分别用猪链球菌2型(SS2)和7型(SS7)攻毒。结果显示,ΔSsPepO/ΔSsPspC免疫后,针对SS2攻毒能够提供100%的免疫保护,对SS7攻毒能提供60%的免疫保护。免疫组临床症状和肺损伤指数明显低于阴性对照组和空白组。攻毒后病理切片的结果也表明免疫组的病理变化不明显。以上研究结果进一步表明双基因缺失突变株ΔSsPepO/ΔSsPspC具有开发成猪链球菌2型的新型弱毒疫苗的潜力,为防控猪链球菌2型的感染提供一个新的策略。