研究背景目前关于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的所有研究,包括基因组学、转录组学和蛋白质组学等大量科学成果的获得,都是基于1882年Robert Koch对结核病(Tuberculosis,TB)的病原体是具有传染性的结核分枝杆菌这一现象的发现。虽然随后相关的诊断及治疗方法不断发展,但结核病至今仍然是一个全球性的公共卫生问题。据世界卫生组织(World health organization,WHO)报道,全球每年新增大约900万人感染结核分枝杆菌(包括处于感染活跃期和感染潜伏期两类),同时全球每年有大约150万人死于各种类型的结核病,因此,结核分枝杆菌是主要的单一感染致死病原菌。引起这一现象的原因可归结于结核分枝杆菌通过不断进化,使其拥有一套复杂的感染机制;人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染增加了合并感染结核分枝杆菌的风险;日益增加的新发耐药、多重耐药及全耐药的结核分枝杆菌感染病例等。据报道,2014年全球范围新发感染人数为960万,其中40万为HIV感染者。2013年全球范围内约有48万新增多重耐药结核分枝杆菌病例。除了结核分枝杆菌之外,结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)同样也可以引起肺结核。同时,鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex,MAC)和结核分枝杆菌复合群一样,都是从呼吸道感染中分离出来的。鸟分枝杆菌复合群多与肺部非结核分枝杆菌感染相关。快速诊断肺结核及肺外结核在治疗及控制疾病传染方面至关重要。尽管培养出病原菌是诊断结核病的金标准,但由于分枝杆菌培养耗时巨大,在临床上很少用到这一方法。因此,为了区分临床上肺部感染是由哪种病原菌引起,需要进行一系列生化检验及分子生物学检测等,目前常用的方法为主要为聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、实时定量PCR(Real time polymerase chain reacton,RT-PCR)等。上述方法虽然比传统方法更节省时间,但是操作及分析难度明显增加,且由于扩增下限的存在无法对早期轻度感染进行准确判断。因此,建立一种更敏感、更快捷的检测方法对于临床预防及治疗结核病具有极其重要的意义。表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)是一种光学物理现象,其原理是光发生折射及反射时,当入射角超过临界角(折射角为90度的入射角)时,理论上会出现全内反射现象。但是渐逝波(Evanescent wave)的存在使能量呈现出指数衰减。此时如果在反射界面涂一层薄的金膜或者银膜,因受入射光激发导致其表面自由电子产生电荷振荡,与渐逝波产生能量耦合,称为表面等离子体共振。以上述理论为基础建立的SPR生物传感器是学科交叉(物理学及生物学)的结合产物,出现于上世纪80年代,通过利用光在两种不同介质之间的反射及折射作用,检测生物芯片表面结合的生物分子质量的改变情况。近年来S P R传感器的研究和发展非常迅速。由于S P R传感器在实际应用中具有诸多优势,如:不用标记、样品用量少、可以实时在线检测以及灵敏度很高等,因此S P R传感器已经广泛用于各种生物分子(脂类、蛋白、核酸、细胞、细菌、病毒等)生物学特性的检测。滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)是在P C R基础上发展而来的一种可以在恒温条件下扩增DNA片段的技术。RCA基本理论形成于上世纪90年代中期,最初使用的是Exo-minus Klenow和Bst DNA多聚酶。由于P hi 29 DNA聚合酶具有更高的持续扩增能力以及链置换能力,因此于1998年开始使用P hi 29 DNA。RCA反应中的模板为环形的DNA分子,引物是和环形的DNA模板互补的一段短序列,通过P hi 29 DNA聚合酶的作用,扩增形成长单链DNA片段,从而可以在很短的时间内扩增出很多重复的串联DNA序列,实现信号的放大。这一技术因其自身特点,所以不需要精密的温度控制系统,扩增过程中扩增产物为线性长片段,更适合现场试验及即时检测。RCA在合成DNA的过程中,因其不会扩增产生新的单链DNA(Single-stranded DNA,ss DNA)3‘端(做为引物),因此具有较强的抗污染能力。RCA技术操作及反应简洁迅速,可以和芯片实验室技术结合用于多通路分析、便捷分析。因此,RCA技术应用比较广泛。指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是一个完善的、高效的技术,用于来筛选具有高靶标亲和力的寡核苷酸片段。经过不断的发展,在原有的SELEX技术上进行了许多改进,缩短了筛选时间,提高了筛选的效率及降低了筛选成本。由这些技术筛选出来的单链DNA或是RNA分子被称作适配体(Aptamer),这些适配体可以特异性结合靶标物质,如蛋白、细胞、微生物,甚至是化合物等。适配体作为一种“新型抗体”,蕴含着巨大的应用潜能,比如癌症的基因治疗及生物医学研究等。在本实验室各位前辈的前期研究基础之上,本研究将液相RCA反应与表面等离子体共振生物传感器技术结合起来,探索了一种基于表面等离子体共振生物传感器恒温条件下RCA扩增检测体系,优化反应体系,测定整个体系的灵敏度及反应特异性,通过病原菌相对保守的内转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)设计锁式探针(Padlock probe,PLP),用以区分检测结核分枝杆菌复合群及鸟分枝杆菌复合群。然后通过SELEX方法筛选流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)特异性适配体,并在筛选过程中增加反筛步骤,以减少非特异性适配体出现的几率。对于筛选出来的3条适配体用软件预测其二级结构,测定其亲和性及特异性,并选用亲和性最高的适配体用于临床标本的检测。方法1.在本实验室前期研究工作基础之上,进一步改进SPR传感器的各种参数,包括硬件及软件。增加传感器芯片表面检测池的数量,对温度控制系统进行升级,对流速控制系统进行改进,并优化芯片表面自组装条件。2.通过Gen Bank查找结核分枝杆菌基因信息,确定其16s-23s r RNA基因的内转录间隔区序列,然后设计锁式探针,在锁式探针上加入酶切位点并进行硫代硫酸化修饰,测定反应体系的敏感性及特异性,优化反应体系条件。3.建立SPR传感器通过靶序列的RCA扩增对结核分枝杆菌DNA的实时在线检测方法。4.通过SELEX方法筛选流感嗜血杆菌特异性适配体。以整个流感嗜血杆菌菌体为靶标,体外合成构建一个长度为81个nt的随机ss DNA文库,两端为固定序列,中间35个nt为随机序列,库容量大约为1015。库的序列为:5‘-C C C C T G C A G G T G A T T T T G C T C A A G T-(N 3 5)-A G T A T C G C T A A T C A G G C G G A T-3‘,设计两端引物,序列为:引物I:5‘-C C C C T G C A G G T G A T T T T G C T C A A G T-3‘,引物II:5‘-A T C C G C C T G A T T A G C G A T A C T-3‘。共进行12轮筛选,并且在10-12轮的时候进行反筛,以提高适配体特异性。5.预测筛选到的适配体的二级结构,并测定其亲和性及特异性。选择其中亲和性最高的一条适配体用于临床标本检测。将适配体生物素化后固定在芯片表面,然后在S P R生物传感器上检测流感嗜血杆菌阳性标本。结果1.改进后的SPR传感器操作系统更稳定、精密,温度控制系统精度可以达到±0.1℃,温度变化范围在20-60℃之间,且传感器检测池处于负压状态下;流速控制系统精度可以达到±1μl/min,可控范围在5-2000μl/min之间;使用的芯片规格为8通道的镀金膜棱镜芯片,尺寸为20mm×28.6mm,镀膜为50nm厚。改进后的系统中探针通过巯基末端修饰-共价结合法固定在芯片表面。2.根据Gen Bank查找后设计探针序列为:M T B C靶标1序列:3’-C A C A C A A C C A C C G G T T G A A A C A A C A G T A C G T G G G C C G A G A G;MTBC靶标2序列:3’-C A C A C A A C C A C C G G T T G A G A C A A C A G T A C G T G G G C C G A G A G;MAC靶标序列:3’-C C T C C C T G A G G T G T G C C T G C C T G G C T C A C A A C A G A G T C C C G G;MTBC P L P序列:3’-T T C A A C C G G T G G T A T C A T G A T T T T T A C G C G T C C A G C T A C G A C T C C A G C G T G T C T G T A T A T C T G G G C C C A C G T A C T G T T G T–P;M A C PLP序列:3’-G C A C A C C T C A G G G A T C A T G A T T T T T A C G C G G C T A A T G G C C A G G C T A C G A C G T C T G T A T A T C T G T G T T G T G A G C C A G G C A G–P;MTBC巯基化探针序列:3’–H S–(CH2)6–(T)20T C C A G C T A C G A C T C C A G C G T;MAC巯基化探针序列:3’–H S–(CH2)6–(T)20G C T A A T G G C C A G G C T A C G A C。3.成功组建了液相RCA靶序列扩增SPR传感器检测体系,应用这一方法我们可以在恒温条件下快速检测MTBC及MAC。我们所设计的锁式探针在反应过程中使得RCA扩增反应同酶切反应同步实施,因此可以做到实时在线且无标记监测,SPR生物传感器的检测下限是:MTBC:4.2×104CFU/ml,相当于0.005ng/μl;M A C:3.7×104CFU/ml,相当于0.002ng/μl。4.经过12轮SELEX筛选得到流感嗜血杆菌特异性适配体6条,经分析比对表明,适配体之间序列一致性为80.32%,其中3条适配体与流感嗜血杆菌亲和性OD值大于1.5,且与反筛组亲和性测定OD值小于0.5,表明其特异性良好。5.适配体特异性检测结果表明流感嗜血杆菌组SPR信号值为519.9±49.1 mo,分别明显高于反筛组两种病原菌的SPR信号值(溶血嗜血杆菌:50.5±14.7 mo;副溶血嗜血杆菌:39.5±8.6 mo,P<0.01)。表明适配体在检测系统中的特异性很高。检测的12例临床流感嗜血杆菌感染阳性标本中,除1例检测结果为假阴性外,其余SPR生物传感器检测结果均为阳性。结论1.优化后SPR生物传感器具有良好的性能,能够对传感器设备小型化以及便携性提供坚实的基础。2.本研究中所设计的锁式探针特异性好,加入酶切位点后可以在传感器芯片表面进行RCA扩增反应,使得SPR生物传感器可以在恒温条件下快速检测MTBC及MAC,为临床检验提供一种新方法。3.本研究通过SELEX技术,以流感嗜血杆菌为靶标筛选出其特异性适配体,为流感嗜血杆菌的临床检测提供一种新方向。