线粒体蛋白主要由细胞核基因编码,部分蛋白由线粒体基因编码,当线粒体内未折叠蛋白或错误折叠蛋白质积累时,会将信号传递到细胞质和细胞核,激活一系列分子伴侣,蛋白酶等基因的表达以促进线粒体恢复正常蛋白稳态和功能,这一反应被称为线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt),在后生动物抗病原感染免疫中发挥重要作用。目前UPRmt在哺乳动物研究中相对较少,线粒体内错误折叠蛋白积累如何将信号传递到线粒体外并诱导细胞核转录程序激活还不清楚。转录因子ATF4、ATF5和CHOP被认为参与了UPRmt转录调控,同时有证据表明诱导UPRmt会引起eIF2α磷酸化以及翻译阻断,UPRmt中eIF2α磷酸化如何调控ATF4、ATF5和CHOP转录因子的表达和激活?线粒体错误折叠蛋白积累如何激活eIF2α激酶并磷酸化eIF2α的呢?哺乳动物UPRmt是否具有和秀丽隐杆线虫UPRmt天然免疫作用呢?基于以上科学问题,本课题开展以下研究:首先,本研究建立了快速、特异的UPRmt诱导体系。Gamitrinib-triphenylphosphonium（G-TPP）是线粒体分子伴侣HSP90特异抑制剂。G-TPP处理会引起线粒体蛋白错误折叠积累和UPRmt,为了便于后期研究,筛选了一系列细胞系,最终发现人肝癌细胞系SMMC7721和男性慢性粒细胞白血病HAP1细胞系对G-TPP响应良好,eIF2α磷酸化和ATF4蛋白水平上调显著,CHOP转录水平（P＜0.01）和蛋白水平上调。进一步细致分析了2种细胞对G-TPP处理的响应时间和强度,结果显示G-TPP处理30 min就可以引起eIF2α磷酸化水平升高,1 h引起ATF4蛋白水平显著升高。延长处理时间到9 h和12 h,这种现象依然存在,还发现能引起CHOP蛋白水平显著升高,然而,ATF5在转录和蛋白水平表达无差异变化。另外,G-TPP处理未引起内质网应激反应BIP基因在转录和蛋白水平的上调。ISR抑制剂ISRIB处理会抑制ATF4蛋白水平升高,我们构建了eIF2αS51A+/-杂合小鼠,使用G-TPP处理杂合小鼠来源的MEFs细胞,ATF4蛋白水平升高明显低于野生型MEFs细胞,证明eIF2α磷酸化对于诱导ATF4蛋白水平升高是必需的。敲低ATF4细胞证明CHOP基因转录受ATF4调控。eIF2α磷酸化会引起细胞内整体蛋白翻译水平的降低,但是部分分子伴侣和蛋白酶翻译会增加。为了研究G-TPP诱导UPRmt后细胞内活跃翻译基因的改变,我们进行了Ribo-Seq实验。研究发现HSPA1B、HSPA1A、HSPA6、HSPA8、DNAJB1等热休克蛋白,细胞色素P450酶CYP1A1和CYP1B1,以及转录因子DDIT4与多聚核糖体结合增多,说明在UPRmt过程这些基因活跃翻译;同时ATF4翻译水平上调,CHOP在转录水平和翻译水平均显著上调。值得注意的是:ATF5、HSP60、HSPE1、CLPP和LONP1在转录水平和翻译水平均未出现上调,这与我们之前的数据是一致的。进一步对差异表达基因（DEGs）（q value＜0.05）进行GO富集和KEGG通路富集,发现DEGs主要富集于蛋白折叠、细胞凋亡、细胞应激反应、细胞稳态、寿命调节、内质网蛋白加工、阿尔茨海默病、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路等方面。在此基础上,使用RNA干扰和CRISPR-Cas9基因编辑分别构建了4种eIF2α激酶（PERK、PKR、GCN2和HRI）敲低和敲除细胞系,并确定HRI通过eIF2α磷酸化介导UPRmt。敲除HRI后ROS下降有所缓解,线粒体膜电势去极化显著性降低,细胞凋亡程度加重,说明在UPRmt条件下,HRI调节线粒体的功能。探讨了线粒体错误折叠蛋白激活HRI,磷酸化eIF2α的机制。首先我们对线粒体形态进行了电镜检测,G-TPP处理4 h线粒体形态正常,处理6 h后,线粒体形态变圆、肿胀、脊消失,而内质网结构正常,说明G-TPP处理只特异地作用于线粒体,由于G-TPP激活UPRmt在1～2 h就可以发生,这一时间段线粒体形态正常。G-TPP处理后未引起ROS的上升。G-TPP处理引起线粒体膜电势发生去极化、氧化磷酸化过程和糖酵解过程均受到严重损害,这说明线粒体氧化呼吸链蛋白代谢速率很快,短期抑制线粒体蛋白折叠功能就会引起氧化磷酸化降低。接着使用MAVS-Turbo ID标记线粒体外膜,证明UPRmt过程细胞质中的HRI迁移到线粒体外膜附近。在HRI敲除的HAP1细胞中回复表达了HRI-Turbo ID,质谱鉴定结果显示66个蛋白与HRI互作。G-TPP诱导的UPRmt会特异抑制线粒体蛋白的水平,如COX、CS和TIM23,然而,胞质蛋白,如GOT和LAMP1的蛋白水平无明显差异。以上结果表明在UPRmt条件下,eIF2α磷酸化抑制线粒体蛋白翻译,降低输入线粒体数量以减轻线粒体负担,给线粒体足够的空间和时间恢复正常功能和蛋白稳态。在阐明哺乳动物UPRmt分子机制的基础上,初步探究UPRmt对病毒复制的影响,结果发现G-TPP诱导UPRmt抑制水疱性口炎病毒（VSV）蛋白合成。进一步利用本研究eIF2α激酶基因敲除或敲低的SMMC7721细胞,分析eIF2α激酶对病毒的调控机制。western blot检测表明PERK抑制VSV的复制,PKR和GCN2促进病毒的复制,HRI对病毒复制无显著影响,初步结果说明哺乳动物的UPRmt参与调控病毒蛋白复制。综上所述,本研究阐明G-TPP通过HRI-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路快速激活UPRmt。在UPRmt过程中,HRI磷酸化eIF2α对于UPRmt至关重要,HRI迁移至线粒体外膜附近与多种蛋白互作,磷酸化的eIF2α主要抑制线粒体功能。另外,G-TPP诱导UPRmt和ISR参与调节VSV病毒蛋白合成,这将为进一步阐明UPRmt在病毒感染、天然免疫和疾病治疗方面奠定理论基础。