胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是目前最常见的成人脑肿瘤之一,以远处转移率低,进展迅速和死亡率高为主要临床特征,平均治疗后生存时间仅为12-18个月。目前脑胶质瘤治疗方法为显微手术和术后辅助放化疗,胶质母细胞瘤细胞对化学药物的高耐受性严重影响了病人术后无病生存时间。因此深入研究胶质母细胞瘤发生发展的分子机制以及耐药机理,对明确脑胶质瘤的诊治具有重要的理论意义和临床应用价值。近年来,脑胶质瘤肿瘤干细胞理论研究成为胶质瘤病因学研究的焦点和热点。该理论认为：恶性胶质瘤中存在极少部分具有自我更新和分化能力的胶质瘤干细胞(约占肿瘤细胞的1%)。恶性胶质瘤患者手术或者放化疗后,胶质瘤干细胞由于微环境稳定性的破坏而快速增殖,其中一部分仍然维持原有的干细胞特性,即自我更新能力(self-renewal);而另一部分可以定向分化(differentiation)为成熟的胶质瘤细胞,成为胶质瘤复发的根源。因此胶质瘤干细胞是恶性胶质瘤复发的“种子细胞”。β-catenin蛋白是肿瘤发生发展中的关键信号分子之一,在恶性脑胶质瘤等多种肿瘤中广泛表达。在Wnt配体刺激下,细胞发生级联信号反应,导致β-catenin进核后调节wnt下游基因,进而活化Wnt/β-catenin信号通路。胃肠道肿瘤中腺瘤结肠息肉基因(adenomatous polyposis coli, APC)的缺失或突变通过影响β-catenin(?)急定性而上调β-catenin蛋白表达,导致细胞的增殖过度和早期癌变,但脑胶质瘤中APC基因和β-catenin编码基因CTNNB1的突变并不多见。因此目前对胶质瘤细胞核中p-catenin高表达及高活性状态的分子机制尚不清楚。最近研究发现,Wnt/β-catenin信号通路参与调控神经干细胞的自我更新及分化,鉴于胶质瘤干细胞具有的“干细胞”特性,是否存在Wnt/β-catenin信号通路调控胶质瘤干细胞有待明确。据此,我们推测,Wnt/β-catenin信号通路可能通过调控胶质瘤干细胞参与胶质瘤细胞的发生发展,目前对其可能的作用机制尚需研究。FoxM1 (Forkhead Transcription Factor M1)属于Fork Head (Fox)转录因子家族,是调节细胞周期的关键分子之一,在DNA合成前期/DNA合成期(G1/S)表达迅速增加,促使细胞进入DNA合成期和有丝分裂期,而其自身表达在G2/M期也达到最高。FoxM1的异常表达可导致细胞分裂加速和增殖失控,参与肿瘤早期发生,并在包括脑胶质瘤等多种实体性恶性肿瘤中过表达。在本课题中,我们通过对胶质母细胞瘤病人来源的肿瘤细胞进行体外原代培养,获得胶质母细胞瘤干细胞,并对其细胞形态学,裸鼠颅内成瘤能力以及分化能力进行了鉴定；进一步研究发现,FoxM1和β-catenin基因沉默导致胶质瘤干细胞体外克隆形成能力显著下降,Nestin、Sox2、Musashi-1等神经干细胞标记物表达降低,GFAP、Tuj-1以及04等神经干细胞分化标记物表达升高；以及裸鼠体内致瘤能力下降；胶质瘤病人组织样本中FoxM1表达与β-catenin的表达具有明显正相关性,FoxM1/β-catenin与神经干细胞标记物Nesin呈正相关,与神经干细胞分化标记物GFAP呈负相关。研究结果表明FoxM1与β-catenin蛋白对维持胶质瘤干细胞自我更新抑制干细胞分化具有重要的调控作用。我们进一步探讨了FoxM1和β-catenin调控胶质瘤干细胞的分子机制并发现,FoxM1沉默可抑制β-catenin分子转运入核,而β-catenin沉默能显著减低FoxM1过表达导致的裸鼠致瘤能力；Wnt通路配体Wnt3a可促进FoxM1和β-catenin的表达并促进二者协同转运入核；FoxM1可以与β-catenin共同作用在Wnnt下游基因LEF的启动子上促进LEF的转录活性。综上研究结果,FoxM1可能与β-catenin/TCF4形成转录复合物共同作用于Wnt下游基因的启动子上并激活启动子,在转录水平调控Wnt下游靶基因的表达,进而维持胶质瘤干细胞的生物学活性。第一部分：人脑胶质瘤干细胞的分离、培养和鉴定提取胶质母细胞瘤病人肿瘤组织细胞,在含生长因子EGF和bFGF的培养基中进行原代培养,诱导细胞形成神经球状肿瘤干细胞团。挑取三株肿瘤干细胞(分别命名为MD11、MD20s和MD23),分别进行裸鼠颅内注射,发现1000个MD11和MD20s细胞,5000个MD23细胞即可在裸鼠颅内成瘤,显示了强致瘤性。免疫组织学方法检测成瘤组织病理形态,证实成瘤组织具有与来源胶质母细胞瘤病人相近的组织学形态(高侵袭性,肿瘤组织坏死,肿瘤微血管增生等)。将三株不同病人组织来源的胶质瘤干细胞在含有2%胎牛血清的培养基中培养7-10天后,细胞可贴壁生长。血清诱导培养肿瘤干细胞团可时相性上调神经元细胞标记物Tuj-1和星形胶质细胞标记物GFAP(?)勺mRNA和蛋白水平表达,抑制Nestin、CD133、CD 15等神经干细胞标记物的表达。通过细胞形态学,细胞致瘤性以及细胞分化能力的鉴定,证实该方法提取的原代培养细胞为胶质瘤干细胞,并可用作胶质瘤干细胞体外研究模型。第二部分：FoxMl与P-catenin在人脑胶质瘤干细胞中的功能研究为了研究FoxM1(?)(?)P-catenin在胶质瘤干细胞中的功能,我们首先构建了表达sh-FoxM1和(?)sh-β-catenin的慢病毒,然后分别稳定转染至MD11和MD20s两株胶质瘤干细胞中。FoxM1和β-catenin基因沉默显著减低胶质瘤干细胞的成球数量以及成球体积,即胶质瘤干细胞的自我更新能力。将胶质瘤干细胞系形成的细胞球再次消化成单个细胞,进行第二次成球实验,发现FoxM1和P-catenin沉默进一步减低了胶质瘤干细胞的成球数量以及成球体积,证实FoxM1和β-catenin对维持胶质瘤干细胞的自我更新能力具有关键作用。进一步通过免疫印迹和细胞免疫荧光方法检测神经干细胞自我更新分子标记物CD133、Nestin、Sox2和Musashi-1,以及神经干细胞分化分子标记物Tuj-1(神经元标记物),GFAP(星形胶质细胞标记物)的表达,发现抑制(?)FoxM1(?)(?)β-catenin均能使CD133, Nestin, Sox2(?)(?)Musashi-1的表达下降,而Tuj-1和GFAP升高,证实FoxM1和P-catenin对调控胶质瘤干细胞自我更新及分化具有重要作用。第三部分：FoxMl与P-catenin对人脑胶质瘤细胞致瘤性以及在人脑胶质瘤样本中表达的研究采用裸鼠颅内原位注射细胞方式建立成瘤模型,结果显示原代培养的胶质瘤干细胞具有强致瘤能力,而FoxM 1或者β-catenin稳定敲除的胶质瘤干细胞不能在小鼠脑内成瘤。进一步研究发现,过表达FoxM1可导致无成瘤能力的胶质瘤细胞系SW1783和HS683成瘤,敲除P-catenin显著抑制FoxM1过表达导致的强致瘤作用。体内实验表明FoxM1和β-catenin对维持胶质瘤干细胞的高致瘤性具有重要作用,同时β-catenin部分协同促进FoxM1在胶质瘤细胞中的致瘤作用。免疫组织化学方法检测40例人恶性脑胶质瘤组织切片中FoxM1和β-catenin的表达及相关性,结果显示,FoxM1在14例标本中中等强度表达,18例标本中高强度表达。胞核内FoxM1与β-catenin呈明显正相关表达。此外,在8例FoxM1(?)日性的恶性脑胶质瘤的连续冰冻切片上,FoxM1与β-catenin呈明显正相关表达,并且FoxM1与Nestin(神经干细胞分子标记物)正相关表达,与GFAP(星形胶质细胞标记物,神经干细胞分化标记物)呈负相关性表达。以上实验说明恶性胶质瘤中FoxM1和β-catenin协同异常表达,FoxM1能够促进胶质瘤其实细胞的自我更新能力。第四部分：FoxMl与β-catenin调控人脑胶质瘤干细胞的分子机制研究为进一步明确FoxM1与β-catenin协同促进胶质瘤发生发展的分子机制,本课题从FoxM1基因敲除老鼠的大脑SVZ区域提取神经干细胞进行原代培养,在培养细胞中加入cre腺病毒诱导敲除FoxM1基因后发现,细胞中β-catenin入核被完全抑制而积聚在胞浆中。在脑胶质瘤干细胞MD11、MD20s细胞系中敲除FoxM1,导致胞核中的β-catenin呈FoxM1依赖性表达减低,外源性转染FoxM1可恢复β-catenin的胞核表达水平,而不影响β-catenin总蛋白表达。上述研究表明FoxM1影响了β-catenin在胞核内的水平,而不影响细胞中β-catenin总蛋白水平的表达。在293T细胞中转染带有红色荧光标记的DsRed-N1-FoxM1与绿色荧光标记的CFP-β-catenin,通过激光共聚焦显微镜记录荧光强度的变化,实时检测加入Wnt3a后FoxM1与P-catenin在细胞内的表达以及定位。结果表明,加入wnt3a后红色荧光和绿色荧光随时间强度递增。而在FoxM1基因敲除的老鼠胚胎成纤维细胞中加入Wnt3a,β-catenin并未入核。结果说明,Wnt3a能够增力(?) FoxM1及β-catenin的表达,促进二者入核,FoxM1在该信号转运过程中起到桥梁作用。β-catenin是Wnt信号转导通路中的关键信号分子,Wnt通路活化促进β-catenin在胞浆中积聚并进入胞核,作用在TCF/LEF启动子的TCF DNA结合元件(TCF-binding DNA elements(TBEs)/Wnt response elements(WREs))上,在转录水平调控Wnt靶基因的表达,通过检测TOP-Flash活性可明确Wnt通路的转录调控活性。本实验发现,FoxM1蛋白在293T细胞,脑胶质瘤细胞系(HS683、SW1783)、胶质瘤干细胞(MD23、MD20s、MD11、MD7-2、MD6-27)中表达逐渐升高,同时相应的TOP-Flash(?)舌性平行升高,说明FoxM1可能与β-catenin协同促进Wnt通路对靶基因的转录活性调控。本课题进一步发现,过表达FoxM1能够上调野生型LEF-1启动子活性,而WREs发生突变的LEF-1启动子活性不受影响。应用染色质免疫共沉淀技术检验MD11细胞中检钡(?) FoxM1与WREs是否结合,结果表明FoxM1与β-catenin、TCF4共同作用在LEF-1启动子的WREs,在293T细胞中加入Wnt3a能够促进FoxM1与β-catenin结合在WREs。通过二次染色质免疫共沉淀技术发现FoxM1(?)(?)β-catenin共同作用在LEF-1启动子的WREs区域中。为进一步研究FoxM1在β-catenin/TCF转录复合物中可能的角色,本实验在MD11细胞中干扰FoxM1表达,通过染色质免疫共沉淀实验发现FoxM1表达下降降低β-catenin与WREs的结合。反之,β-catenin的表达降低会影响FoxM1与LEF-1启动子WREs区域的结合。据此,我们首次发现,FoxM1与β-catenin形成转录复合物,共同作用在TCF/LEF的TBEs/WREs区域,参与Wnt下游靶基因的转录调控,参与胶质瘤干细胞自我更新能力和分化能力的调节。