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目的:
生物体内源性代谢物在维持机体平衡过程中具有重要的作用，其浓度变化常常与多种疾病密切相关。建立内源性代谢物靶标代谢组学分析平台、监测代谢物的动态变化，有助于阐明代谢变化与疾病之间的关系，促进疾病诊断及药物开发。本研究采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术，根据代谢通路分析、文献研究以及前期研究基础，选取不同代谢通路中重要代谢物，分别建立3个靶标代谢组学分析方法，定量测定生物样品中目标代谢物的含量，并且动态监测肥胖大鼠模型中目标代谢物的含量-时间变化，对高脂饮食诱导的肥胖模型产生的代谢变化及肠道菌群失调进行全面探讨，以建立可靠、实用的内源性代谢物靶标代谢组学分析平台。
方法:
1.建立同时测定大鼠血清、尿液及粪便中9种肠道菌群-宿主共代谢物的LC-MS/MS方法
采用LC-MS/MS方法对生物样品中9种肠道菌群-宿主共代谢物进行定量测定，包括苯甲酸、苯乙酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、3.4-二羟基苯乙酸、吲哚乙酸、吲哚丙酸以及5-羟基吲哚乙酸。该方法以甲醇和0.05％甲酸-水溶液作为流动相进行梯度洗脱，使9种肠道菌群-宿主共代谢物在反相C18柱上实现了较好地分离，运行时间为7分钟。本研究进行了全面的方法验证，验证参数包括线性、定量下限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应及稳定性。此外，还将该方法应用于高脂饮食诱导的肥胖模型中，实现对肠道菌群-宿主共代谢物的动态监测。
2.建立同时测定大鼠血清及粪便中18种胆汁酸的LC-MS/MS方法
基于LC-MS/MS分析技术，开发简单、快速的针对生物样品中18种胆汁酸的靶标代谢组学分析方法。在该方法中，以乙腈-水(含有10mmol/L乙酸铵溶液及0.05％甲酸溶液)作为流动相进行梯度洗脱，10分钟内，18种胆汁酸在苯基己基柱上得到了很好地分离。本研究生物样品的处理主要是通过有机溶剂进行蛋白质沉淀完成的。除完成全面的方法验证，还将该方法应用于肥胖大鼠模型中，以考察方法的可靠性及实用性，同时获得在造模不同时间点大鼠体内胆汁酸含量的动态变化等相关信息。结合通路分析及文献研究，对胆汁酸代谢变化进行解析，深入探讨胆汁酸代谢、肠道菌群与肥胖三者之间的关系。
3.建立同时测定大鼠血清、尿液及粪便中12种糖代谢产物的LC-MS/MS方法
采用LC-MS/MS技术，针对生物样品中12种糖代谢产物，建立靶标代谢组学分析方法对目标代谢物进行含量测定。以乙腈-水(含有0.025％NH4OH)作为流动相进行梯度洗脱，采用亲水色谱柱对12种目标代谢物进行了快速分离，运行时间为6分钟。方法验证主要考察了线性、定量下限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应及稳定性这7项指标。最后，采用建立的方法定量测定肥胖大鼠生物样品中这些糖代谢产物的浓度，并对测定结果进行进一步分析。
结果:
1.建立了基于LC-MS/MS的针对9种肠道菌群-宿主共代谢物的靶标代谢组学分析方法，可同时测定大鼠血清、尿液及粪便样品中这9种共代谢物的含量。该方法精密、准确、可靠，样品处理方法简单快速、分析时间短，适用于高通量定量分析。另外，该方法成功应用于肥胖模型中，发现在肥胖大鼠体内涉及这9种待测物的肠道菌群-宿主共代谢发生了显著的变化，且这一变化随高脂饮食喂养时间增加而增大。
2.建立了采用LC-MS/MS技术同时测定大鼠血清及粪便中18种胆汁酸的靶标代谢组学分析方法。方法的线性、定量下限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应以及稳定性均符合生物样品分析要求。此外，该方法已成功地应用于监测肥胖大鼠体内胆汁酸的含量变化，结果表明高脂饮食诱导4周后模型大鼠体内胆汁酸浓度分布已完全与未造模时期分开，并且，随着造模时间的增加，这种变化愈加明显。
3.开发了针对12种糖代谢产物的靶标代谢组学分析方法，采用LC-MS/MS技术对这12种目标代谢物进行定量测定。该方法线性关系良好，灵密度强、准确度高、精密度好，适用于生物样品中这些糖代谢产物的定量分析。另外，该方法实用性强，已成功应用于肥胖大鼠模型中目标代谢物的动态监测，结果显示，经过12周高脂饮食的诱导，大鼠的代谢轨迹逐渐偏离其初始位置，而这种代谢变化与肥胖及其并发症密切相关。
结论:
本研究通过开发3个靶标代谢组学分析方法，对肠道菌群-宿主共代谢物、胆汁酸及糖代谢产物进行了定量测定，并对这些内源性代谢物在肥胖大鼠模型中的动态变化进行监测，建立可靠、实用的内源性代谢物的靶标代谢组学分析平台。这一平台的建立有助于更加全面地认识疾病中内源性代谢物的变化，可能成为疾病诊断、治疗评估及药物开发过程中的重要工具。
生物体内源性代谢物在维持机体平衡过程中具有重要的作用，其浓度变化常常与多种疾病密切相关。建立内源性代谢物靶标代谢组学分析平台、监测代谢物的动态变化，有助于阐明代谢变化与疾病之间的关系，促进疾病诊断及药物开发。本研究采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术，根据代谢通路分析、文献研究以及前期研究基础，选取不同代谢通路中重要代谢物，分别建立3个靶标代谢组学分析方法，定量测定生物样品中目标代谢物的含量，并且动态监测肥胖大鼠模型中目标代谢物的含量-时间变化，对高脂饮食诱导的肥胖模型产生的代谢变化及肠道菌群失调进行全面探讨，以建立可靠、实用的内源性代谢物靶标代谢组学分析平台。
方法:
1.建立同时测定大鼠血清、尿液及粪便中9种肠道菌群-宿主共代谢物的LC-MS/MS方法
采用LC-MS/MS方法对生物样品中9种肠道菌群-宿主共代谢物进行定量测定，包括苯甲酸、苯乙酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、3.4-二羟基苯乙酸、吲哚乙酸、吲哚丙酸以及5-羟基吲哚乙酸。该方法以甲醇和0.05％甲酸-水溶液作为流动相进行梯度洗脱，使9种肠道菌群-宿主共代谢物在反相C18柱上实现了较好地分离，运行时间为7分钟。本研究进行了全面的方法验证，验证参数包括线性、定量下限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应及稳定性。此外，还将该方法应用于高脂饮食诱导的肥胖模型中，实现对肠道菌群-宿主共代谢物的动态监测。
2.建立同时测定大鼠血清及粪便中18种胆汁酸的LC-MS/MS方法
基于LC-MS/MS分析技术，开发简单、快速的针对生物样品中18种胆汁酸的靶标代谢组学分析方法。在该方法中，以乙腈-水(含有10mmol/L乙酸铵溶液及0.05％甲酸溶液)作为流动相进行梯度洗脱，10分钟内，18种胆汁酸在苯基己基柱上得到了很好地分离。本研究生物样品的处理主要是通过有机溶剂进行蛋白质沉淀完成的。除完成全面的方法验证，还将该方法应用于肥胖大鼠模型中，以考察方法的可靠性及实用性，同时获得在造模不同时间点大鼠体内胆汁酸含量的动态变化等相关信息。结合通路分析及文献研究，对胆汁酸代谢变化进行解析，深入探讨胆汁酸代谢、肠道菌群与肥胖三者之间的关系。
3.建立同时测定大鼠血清、尿液及粪便中12种糖代谢产物的LC-MS/MS方法
采用LC-MS/MS技术，针对生物样品中12种糖代谢产物，建立靶标代谢组学分析方法对目标代谢物进行含量测定。以乙腈-水(含有0.025％NH4OH)作为流动相进行梯度洗脱，采用亲水色谱柱对12种目标代谢物进行了快速分离，运行时间为6分钟。方法验证主要考察了线性、定量下限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应及稳定性这7项指标。最后，采用建立的方法定量测定肥胖大鼠生物样品中这些糖代谢产物的浓度，并对测定结果进行进一步分析。
结果:
1.建立了基于LC-MS/MS的针对9种肠道菌群-宿主共代谢物的靶标代谢组学分析方法，可同时测定大鼠血清、尿液及粪便样品中这9种共代谢物的含量。该方法精密、准确、可靠，样品处理方法简单快速、分析时间短，适用于高通量定量分析。另外，该方法成功应用于肥胖模型中，发现在肥胖大鼠体内涉及这9种待测物的肠道菌群-宿主共代谢发生了显著的变化，且这一变化随高脂饮食喂养时间增加而增大。
2.建立了采用LC-MS/MS技术同时测定大鼠血清及粪便中18种胆汁酸的靶标代谢组学分析方法。方法的线性、定量下限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应以及稳定性均符合生物样品分析要求。此外，该方法已成功地应用于监测肥胖大鼠体内胆汁酸的含量变化，结果表明高脂饮食诱导4周后模型大鼠体内胆汁酸浓度分布已完全与未造模时期分开，并且，随着造模时间的增加，这种变化愈加明显。
3.开发了针对12种糖代谢产物的靶标代谢组学分析方法，采用LC-MS/MS技术对这12种目标代谢物进行定量测定。该方法线性关系良好，灵密度强、准确度高、精密度好，适用于生物样品中这些糖代谢产物的定量分析。另外，该方法实用性强，已成功应用于肥胖大鼠模型中目标代谢物的动态监测，结果显示，经过12周高脂饮食的诱导，大鼠的代谢轨迹逐渐偏离其初始位置，而这种代谢变化与肥胖及其并发症密切相关。
结论:
本研究通过开发3个靶标代谢组学分析方法，对肠道菌群-宿主共代谢物、胆汁酸及糖代谢产物进行了定量测定，并对这些内源性代谢物在肥胖大鼠模型中的动态变化进行监测，建立可靠、实用的内源性代谢物的靶标代谢组学分析平台。这一平台的建立有助于更加全面地认识疾病中内源性代谢物的变化，可能成为疾病诊断、治疗评估及药物开发过程中的重要工具。