论文部分内容阅读
漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是广泛存在于高等植物、真菌、昆虫和细菌中的一类含铜多酚氧化酶,具有合成与降解双重作用,商品漆酶普遍来源于真菌和植物,通常不适合制浆造纸工业中的高温、中碱性操作条件,细菌漆酶特别是芽孢杆菌属产生的芽孢壳蛋白（CotA）具备优良的耐热性、耐碱性和耐溶剂性。本研究的主要目的是对Bacillus licheniformis产生的两种活性蛋白YlmD和CotA进行外源表达和高温酶活鉴定,研究漆酶与离子液体、木质素模型物转化的反应机制。本研究首先优化YlmD基因的密码子,合成、扩增基因,构建重组pET-28a（+）-YlmD质粒并转Escherichia coli BL21（DE3）,通过诱导表达产生YlmD蛋白并予以纯化、鉴定。与野生B.licheniformis一样,重组子E.coli-YlmD在含2,6-DMP的培养基上产生透明圈,可能通过产生氧化还原酶来抵抗酚和醌类物质的转化。体外测试也验证了YlmD具有还原2,6-DMP醌式结构的功能。推测其活性可能是（1）引发氧化态底物的还原反应,（2）引发氧化态底物的进一步氧化脱色。然后构建了带组氨酸标签的pPIC9K-CotA重组质粒,在Pichia pastoris表达Bli CotA蛋白,培养得到的粗酶液经过层析分离、吸收Cu离子、超滤脱盐,纯化得到含量高于82%的CotA蛋白。为了鉴定BliCotA的高温催化特性,开发了一种高温条件下测试漆酶活力和动力学的系统,工作温度为583°C,检测分辨率能达到0.0001 Abs,光谱仪具备连续快速扫描全波长光谱的功能。应用这一系统比较了BliCotA、诺维信漆酶（Novozyme 51003,文中简写为N 51003漆酶）和平菇漆酶的高温酶活性能,Bli CotA漆酶是嗜热性酶,其最适条件:pH 4,温度80oC,最高酶活32 U/mg,该酶没有显著的耐碱性,pH 9时酶活保留率低于5%。N 51003漆酶是一种酸性耐热酶,其最适条件:pH 4.5、温度60oC,最高酶活8.9 U/mg。该酶能耐受80oC的高温,也不具备耐碱性。用BliCotA/HOBT在50oC能对硫酸盐浆达到了很好的脱木质素效果,但在8090oC处理纸浆,会造成漂白浆白度的显著下降。分子模拟分析表明,Bli CotA与MthNov漆酶的Cu离子结合位点均由4个高度保守的氨基酸片段组成,BliCotA与Bacillus subtilis的CotA漆酶同源性最高,比对得到一致性为65.4%,MthNov与Melanocarpus albomyces漆酶亲缘关系最近,序列一致性高于74.4%。以BsuCotA漆酶为模板构建出高质量的BliCotA漆酶模型,QMEAN4和GMQE函数评分分别为-0.5和0.81,以Mal漆酶为模板构建出高质量的MthNov漆酶模型,QMEAN4和GMQE函数评分分别为0.27和0.92,Ramachandran Plot分析证明所有氨基酸构象位于合理区域。对六种木质素单体与BliCotA和MthNov做分子对接模拟,单体均对接到的一个T1Cu附近的疏水口袋区,Bli CotA的疏水口袋是由5个环围成的沟槽状结构,MthNov T1 Cu口袋的外缘呈“回旋镖”形。随着聚合度的增加,木质素模型物在口袋区的结合能越来越低,二者呈线性关系,反映了口袋的尺寸对漆酶底物分子量的限制。烷基咪唑类离子液体通过竞争性结合对漆酶产生抑制作用,烷基链长度越长抑制越显著。通过紫外光谱的红移现象验证了[Bmim]Cl与MthNov漆酶形成漆酶/[Bmim]Cl复合物。