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最近,在果蝇中的研究描绘了一个新的信号通路——Hippo通路。这一通路能同时抑制细胞增殖和促进凋亡,在生长调节方面起重要作用。Hippo激酶级联效应最终拮抗转录共激活因子Yorkie(Yki),从而正向调控参与细胞生长、增殖和存活的靶基因转录。这一系统的进化保守性已由多个实验室证实。哺乳动物YAP(Yki的同源物)能够在体挽救果蝇突变体。YAP在小鼠肝脏过度表达会引起肝脏尺寸大幅度增加,在肠道过度表达会扩大祖细胞池。YAP在鸡胚过度表达导致神经祖细胞池显著扩大。所有这些发现提示:脊椎动物YAP在调控细胞增殖和存活方面有着相当保守的功能。细胞培养和生化实验已经证实YAP能结合并/或共激活一些蛋白和蛋白家族,如Yes、Runx、EBP50、p73、TBX5、p53BP2、TEFs/TEADs、14-3-3、ErbB4、Smad7和hnRNPU等。但是,缺乏一个生理性的实验系统来更好地在体研究YAP的功能。新兴模式生物斑马鱼胚胎透明、体外发育、个体小、繁殖率高、产卵周期长以及鱼种发育遗传背景清晰等优点使其正成为研究脊椎动物胚胎发育过程中基因功能的理想模式系统。2000年,Nasevicius等首次通过注射吗啡啉修饰性寡核苷酸(MO)获得了目的基因特异表达下调的斑马鱼。此方法正作为快速、高效的基因表达下调方法成功应用于斑马鱼,加快了基因功能研究的步伐。利用斑马鱼研究胚胎发育中yap基因的功能具有独特优势。本文第一部分:利用生物信息学的方法证明在脊椎动物进化过程中YAP分子的功能结构域保守。用反义RNA探针-全胚胎原位杂交和RT-PCR的方法研究yap基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。本文第二部分:用靶向yap mRNA的MO(yap-MO)干扰YAP翻译起始,建立了yap基因表达下调的斑马鱼模型。为了验证yap-MO的有效性,我们将其与编码yap-EGFP蛋白质的质粒DNA共注射,结果显示yap-MO抑制了yap-EGFP蛋白的表达,从而也验证了yap-MO能够有效抑制内源性的YAP表达。本文第三部分:在细胞水平上,用原位免疫(荧光)和流式细胞分析方法检测yap基因表达下调后胚胎24 hpf前各个阶段的细胞凋亡和增殖状态。结果显示:在YAP抑制组胚胎的头部和尾部细胞凋亡显著增加,胚胎细胞增殖减少。本文第四部分:在胚胎整体发育水平上,我们主要运用胚胎整体原位杂交和组织化学方法分析yap基因表达下调对背腹轴模式、体节发生、神经系统、血液系统和心血管系统发育的影响:1).在原肠期,yap基因表达下调导致背腹轴标记基因整体表达延迟。同时,背部标记基因goosecoid(gsc)表达减少,腹部标志基因bmp2b表达增强。2).在体节发生期,YAP抑制组胚胎myoD表达显著增强,形成‘u’型体节。3).yap基因表达下调后导致斑马鱼脑部神经前体细胞显著减少,而这种改变是由于相应细胞凋亡增加引起的。4).yap基因表达下调干扰了斑马鱼软骨发生。在YAP抑制组胚胎中,咽弓软骨的缺失是由相应神经嵴细胞丢失引起的。5).yap基因表达下调后,斑马鱼血液系统发生、心脏发生出现了延迟表型,但血管发育并没有明显异常和延迟。