骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨硬化、滑膜增生和骨赘形成为主要病理表现的关节退行性疾病,膝关节是最常见的发病部位,表现为膝关节活动的应力适应性下降。OA的发病机理中,年龄、机械应力和炎症是诱发关节退变的主要因素。慢性炎症在OA发展过程中起着重要作用,尽管炎症反应的发生不一定是引起关节软骨退变的起因,但是其级联放大的反应机制所造成的损伤可以加速软骨退变,并且影响软骨细胞的功能,引起软骨细胞表型的改变和细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的降解,进而导致关节软骨的结构改变和功能丧失。目前针对OA的治疗仍局限于对症治疗。在现代临床药物治疗中,主要选择非甾体类消炎镇痛药和营养软骨类药物来缓解症状,但长期使用这些药物会导致严重的副作用。鉴于OA的病程特点,可能需要长期治疗延缓其进展,因此迫切需要开发研究出一种针对OA疾病长期临床使用安全的方法。研究显示,中医药以及部分食疗中所涉及到的膳食植物、水果或其制成的产品在缓解关节炎的研究中起到了积极作用。这些天然产物种类繁多,主要包含萜类、多酚类、黄酮类、醌类、酚酸类、多糖类、生物碱类、皂苷类等小分子化合物。其中研究相对较多的要属黄酮类化合物,其广泛存在于水果、蔬菜、坚果和谷物中。甜橙黄酮（Sinensetin,SIN）是一种多甲氧基黄酮类化合物,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗血管生成等作用,主要存在于猫须草与柑橘类水果中。猫须草广泛生长在东南亚和热带国家,它的叶子又被称为“爪哇茶”,被用来制作成凉茶。猫须草在当地传统医药中用来治疗风湿病、水肿、痛风和泌尿系统炎症等疾病。同样,柑橘类水果在我国中医治疗中也常被用作传统药物,例如枳实、化橘红、枳壳、陈皮、青皮等,多用于治疗消化不良、支气管炎、哮喘和部分炎症性疾病,其中陈皮在日常生活中也常被用于泡茶,当作茶饮品,并且研究显示陈皮在中药汤剂治疗骨关节炎中发挥了积极作用。许多研究表明,甜橙黄酮不仅对细胞表现出良好的作用活性,而且对正常细胞的毒性非常小,并具有很高的选择性。基于上述研究背景以及前期的数据库药物筛选结果,我们提出应用甜橙黄酮处理OA软骨细胞及OA大鼠模型,观察其作用效果,同时研究其作用机制,期待为今后OA的治疗提供一种新的方法及理论依据。第一部分:甜橙黄酮对人OA软骨细胞的作用效果目的:筛选出研究药物,探索其在体外对人OA软骨细胞的影响。方法:（1）我们首先通过GEO数据库分析获得OA患者对比正常人的差异基因,然后通过cMAP数据库获得具有相互作用关系的潜在药物,再根据TCMSP数据库平台和MCE网站的筛选结果进行限定筛选,最终获得研究对象。（2）提取人OA软骨细胞并进行鉴定,采用不同浓度的甜橙黄酮（0、0.01、0.1、1、5、10、50、100μg/mL）处理软骨细胞24、48、72小时。采用CCK-8法检测甜橙黄酮对软骨细胞活力的影响。（3）EdU法检测甜橙黄酮及IL-1β对人OA软骨细胞增殖能力的影响。（4）流式细胞术检测甜橙黄酮及IL-1β对软骨细胞处理后细胞周期分布情况。（5）采用ELISA试剂盒进行检测不同条件下软骨细胞培养上清液中炎症因子TNF-α与IL-6的分泌含量。（6）qRT-PCR和Western blot法检测不同浓度甜橙黄酮及IL-1β诱导下软骨细胞内炎症因子和ECM合成与分解代谢相关蛋白的表达水平变化。（7）免疫荧光检测软骨细胞内Ⅱ型胶原蛋白的表达变化。结果:（1）经过cMAP数据库、TCMSP数据库和MCE网站的共同筛选,共有15种小分子化合物符合条件,在有排名前5名的化合物中,最终选定甜橙黄酮作为符合条件的研究对象。（2）提取的原代细胞经过鉴定符合软骨细胞特征,CCK-8-检测结果显示浓度为0.1-1μg/mL的区间为甜橙黄酮的安全有效应用范围,可有效保护软骨细胞的增殖能力。（3）EdU检测结果显示IL-1β处理组内处于增殖期间的细胞数目明显减少,而甜橙黄酮处理组内的增殖阳性数目明显增多,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（4）流式细胞术分析结果显示与IL-1β处理组相比,甜橙黄酮处理组细胞内S期所占比例增多,G1期比例相对下降,细胞分裂活跃性较IL-1β处理组明显提升,提示甜橙黄酮可有效提高OA状态下软骨细胞的分裂能力。（5）ELISA检测结果显示甜橙黄酮呈剂量依赖的方式抑制IL-1β诱导的TNF-α和IL-6的产生,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（6）qRT-PCR和Western blot法检测结果提示甜橙黄酮处理组与IL-1β处理组相比,甜橙黄酮可升高Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）的表达,降低基质金属蛋白酶MMP-13、MMP-9以及炎症因子COX2,TNF-α和IL-6的分泌表达。（7）免疫荧光的结果同样显示甜橙黄酮明显增加了软骨细胞内Ⅱ型胶原蛋白的表达量。结论:甜橙黄酮通过减少OA软骨细胞炎症因子和基质金属蛋白酶的释放,抑制了细胞外基质降解,同时可以提高OA软骨细胞的存活率,对软骨细胞起到了保护作用。第二部分:甜橙黄酮对人OA软骨细胞的作用机制目的:探索甜橙黄酮在体外对人OA软骨细胞作用的分子机制。方法:（1）通过转录组测序分析甜橙黄酮处理OA软骨细胞的基因差异变化,利用分子对接筛选出潜在作用靶点。再通过慢病毒转染技术将人OA软骨细胞内靶点敲低,采用Western blot和免疫荧光技术进行检测并验证ECM合成与分解代谢相关蛋白的表达变化。（2）通过数据库分析验证靶点并获得靶点调控的信号通路,然后通过Western blot法和免疫荧光技术进行检测验证。（3）通过TUNEL染色和透射电镜扫描检测软骨细胞DNA损伤情况和形态变化。（4）通过检测LDH释放来评估软骨细胞受损变化。结果:（1）根据转录组测序结果进行限定条件筛选,利用分子对接评估获得靶点基因SERPINA3,通过qRT-PCR、Western blot法和免疫荧光技术进一步检测验证了甜橙黄酮处理后可以升高靶点表达的作用。（2）利用慢病毒敲低SERPINA3靶点后,加剧了软骨细胞的损伤,基质金属蛋白酶和炎症因子的表达上调,而细胞外基质合成减少,应用甜橙黄酮处理后可逆转这一损伤趋势。（3）根据数据库预测以及测序结果分析,SERPINA3对NF-κB/NLRP3信号通路具有调控作用,通过Western blot和免疫荧光技术检测,结果提示甜橙黄酮可以抑制IL-1β以及靶点敲低对NF-κB/NLRP3通路的激活作用,有效抑制了 IκBα和p65的磷酸化以及p65的核易位。（4）TUNEL染色显示甜橙黄酮处理组内的阳性细胞数较IL-1β处理组明显减少,细胞核大小相对比较均匀。（5）透射电镜观察结果显示IL-1β诱导下的软骨细胞细胞肿胀、出现许多空泡化,胞膜表面突起。而甜橙黄酮处理组可明显缓解细胞损伤情况,细胞完整性明显改善。（6）同IL-1β处理组相对比,甜橙黄酮处理组可有效减少LDH的释放,随用药浓度的增加,LDH的释放在逐渐减少。结论:甜橙黄酮可以提高OA软骨细胞内作用靶点SERPINA3的表达,通过调控NF-κB/NLRP3信号通路,可以抑制细胞外基质降解及炎症因子的释放,维持了细胞完整性,降低了 LDH的释放,缓解软骨细胞焦亡,从而发挥软骨保护作用。第三部分:甜橙黄酮对大鼠膝骨关节炎的延缓作用及机制目的:通过建立大鼠OA模型,研究甜橙黄酮体内用药对软骨的保护效果及作用机制。方法:（1）选取4周龄、体重200g左右的Wistar雄性大鼠建立OA模型,随机分为假手术组、OA模型组、甜橙黄酮处理组。喂养治疗6周后,进行热板实验。记录大鼠受到热刺激后产生相应动作反应的时间。（2）获取各组大鼠膝关节标本,依据国际骨关节炎研究协会（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）分级系统评估大鼠膝关节骨关节炎软骨的病理变化。（3）将大鼠膝关节标本进行脱钙、包埋制备切片,采用HE染色法、阿利新蓝染色和番红O固绿染色评估大鼠膝关节软骨组织的病变程度。（4）采用Masson染色和天狼星红染色评估大鼠膝关节软组织病变情况。（5）采用免疫组织化学染色法和Western blot检测膝关节软骨中SERPINA3、MMP-13、Collagen II、COX2和P65及其磷酸化水平以及焦亡相关蛋白NLRP3、ASC和GSDMD的表达情况。（6）通过ELISA法检测各组大鼠血浆内炎症因子IL-1β和IL-18分泌的变化。（7）通过TUNEL染色大鼠膝关节标本切片,判断软骨细胞受损情况。（8）通过HE染色观察肝、肾组织有无异常,初步评价药物毒性作用。（9）收集临床样本获取软骨块,离体培养后通过Western blot、qRT-PCR、番红O染色以及生化成分定量检测来进一步评估甜橙黄酮的作用效果。结果:（1）大鼠OA模型建立成功,所有大鼠均未出现死亡或关节感染的情况。热板实验结果显示甜橙黄酮能有效减轻OA大鼠疼痛反应。假手术组大鼠的OARSI评分接近于正常。软骨表面光滑平整。OA模型组大鼠的OARSI评分最高,软骨破坏最严重,组织结构紊乱,软骨表面粗糙,有较多骨赘形成。甜橙黄酮处理组的评分相较于OA模型组明显降低,骨赘情况及软骨粗糙程度明显改善,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）大鼠膝关节切片HE染色、阿利新蓝染色和番红O固绿染色结果可以清晰显示,假手术组的膝关节软骨层较厚,表面光滑,染色显示软骨细胞数量较多且分布均匀。OA模型组显示关节软骨厚度减少,表面粗糙形状不规则,软骨细胞减少。而甜橙黄酮处理组与OA模型组相比,软骨破坏程度明显缓解,关节内软骨表面的平整度和软骨细胞排列情况均得到改善。（3）根据HE染色、Masson染色和天狼星红染色结果显示,同OA模型组比较,甜橙黄酮处理组内滑膜组织层次清晰,无明显增生,关节周围软组织无明显瘢痕组织形成,粘连明显改善。（4）免疫组织化学染色和Western blot检测结果显示,三组当中,OA模型组内SERPINA3和Collagen II的表达最低,MMP-13、COX2的表达最高,磷酸化的P65、GSDMD和NLRP3也是最高,而甜橙黄酮处理组相较于OA模型组,明显改善了上述情况。（5）通过ELISA检测结果分析可以发现,相较于假手术组,OA模型组内IL-1β和IL-18的产生显著增加,而甜橙黄酮处理组内两炎症因子的表达水平相较于OA模型组显著下降,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。（6）TUNEL染色结果显示甜橙黄酮处理组大鼠膝关节TUNEL 阳性率较OA模型组显著降低。（7）通过HE染色观察病理学结果发现,甜橙黄酮处理组大鼠的肝小叶结构清晰无明显异常,肾小球形态正常,肾小管正常无明显变性坏死迹象。（8）临床样本检测结果显示OA患者与健康人软骨相比较,SERPINA3表达明显降低。而软骨块离体培养检测结果显示,甜橙黄酮处理组促进了 GAG合成和软骨细胞的增殖。qRT-PCR结果显示甜橙黄酮提高了COL2A1和SERPINA3的表达水平,抑制了 P65、NLRP3、GSDMD和ASC的表达水平。结论:甜橙黄酮可以缓解OA大鼠疼痛程度,降低炎症因子和ECM分解因子的表达,延缓了关节软骨破坏,通过调节关节软骨SERPINA3的表达来调控NF-κB/NLRP3信号通路,抑制了大鼠膝关节内软骨细胞焦亡。同时甜橙黄酮可以促进人软骨块基质合成和软骨细胞的增殖,抑制了焦亡相关基因的表达。起到了保护OA关节软骨的积极作用。