背景和目的肠道是人体最大的细菌和病毒库,肠粘膜屏障是机体最重要的防御机制。完整的肠粘膜屏障可以将机体与肠腔内容物隔开,在吸收营养物质的同时,阻止肠腔内细菌及微生物移位。肠粘膜屏障包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障以及化学屏障,维持肠粘膜上皮通透性。上皮细胞间紧密连接(tight junction,TJ)位于上皮细胞周围顶端,由跨膜蛋白occludin、Claudins、JAM(连接粘附分子),以及胞浆蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3、cingulin等组成,是上皮机械屏障最重要的组成部分。紧密连接对维持肠上皮细胞旁通透性起着至关重要的作用,它能够选择性地允许离子及小分子物质通过,阻止肠腔内病原微生物及抗原大分子等通过肠粘膜屏障及进入胞内。紧密连接结构和功能的破坏可引起肠上皮通透性升高,导致肠腔内细菌及内毒素等通过肠上皮进入机体造成局部或全身炎症反应,严重时可导致多器官功能障碍(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS),甚至引起死亡。目前研究发现肠粘膜上皮屏障功能受多种细胞因子及细菌内毒素的调控,并且与多种疾病的发生发展相关,如炎症性肠病、急性重症胰腺炎、中暑、脓毒血症等。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁主要成分,即细菌内毒素,是细菌主要致病因素。正常情况下,肠腔内细菌及内毒素不能通过肠粘膜屏障进入机体,当肠粘膜屏障损伤时,肠道内致病菌及其毒素可进入机体,造成内毒素血症,从而激活机体免役反应,促进炎症因子的释放,导致局部或系统性炎症反应；而炎症反应的发生又可进一步损害肠道粘膜屏障功能。另外,内毒素直接接触肠粘膜上皮细胞时,可通过阻断紧密连接蛋白的磷酸化和去磷酸化过程,直接或间接造成紧密连接的破坏,导致肠粘膜屏障功能损伤和肠粘膜上皮的通透性增加。多个体内和体外实验证实,LPS可破坏肠上皮屏障功能、下调上皮细胞紧密连接蛋白的表达等。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路主要包括p38、ERK、JNK三条,调节着细胞的生长、分化、增殖、凋亡以及炎症反应等多种重要的病理生理过程。近年来有研究发现p38-MAPK通路在调控肠粘膜屏障功能上有一定作用,参与了多种病理生理状态下肠粘膜屏障功能的破坏。而研究表明ERK-MAPK通路与上皮细胞紧密连接以及上皮细胞通透性之间存在相关性,但这种相关性尚存在争议。一部分研究表明激活ERK/MAPK通路可以保护肠上皮细胞完整性以及屏障功能,另外有研究表明ERK/MAPK通路的激活在某些病理情况下参与了肠粘膜屏障功能障碍的发生及发展。而ERK/MAPK在LPS诱导的肠粘膜屏障功能障碍中所起作用的研究较少。重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)的严重并发症包括全身感染、胰腺及胰周脓肿,其致死原因主要为肠上皮通透性增加后肠道细菌移位所引起的全身细菌感染以及胰腺感染,病死率较高。国内有学者通过对急性胰腺炎模型犬进行组织和血液培养,发现实验组培养出细菌主要为大肠杆菌和其他革兰氏阴性杆菌,提示发生肠内细菌移位。Ammori等发现,SAP患者肠道通透性在发病后72h明显增加,而轻型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)则无明显变化。另外有研究却认为在胰腺炎发作后的6h肠道通透性便开始增加,18h后开始出现内毒素和细菌移位。SAP时肠粘膜屏障功能障碍的机制尚不甚清晰,但现在普遍认为SAP时肠道通透性增加与细胞因子和炎症介质的释放、肠道缺血再灌注损伤以及细胞凋亡等因素有关。在其他肠道疾病如IBD中,已有研究表明肠道上皮细胞通透性增加与细胞紧密连接蛋白表达缺失或构型改变有关,而在胰腺炎中尚未见此类研究报道。生长抑素(somatostatin, SST)是一种神经内分泌多肽,目前广泛应用于急性胰腺炎、胰腺手术后预防胰瘘以及上消化道大出血的治疗,最早于1973年由B razeatu等从下丘脑分离出来,并作为生长激素的抑制物而被认识,随后越来越多研究发现其在人体内广泛分布。生长抑素除了能抑制胰液、胰酶和肠液分泌、松弛Oddi括约肌等,目前越来越多的研究表明生长抑素能抑制肿瘤细胞增殖、抑制炎性渗出和白细胞趋化、抑制炎症介质及细胞因子的产生和释放。而肠上皮是生长抑素重要的靶器官,肠上皮细胞表达多种生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR),生长抑素通过与肠上皮生长抑素受体结合,发挥其生物学作用。另外生长抑素还可以通过抑制TLR4-NF-KB减轻肠道缺血再灌注损伤。而近来有研究表明生长抑素对细胞间紧密连接有一定作用。Matthias等发现生长抑素可通过直接作用于紧密连接蛋白,调控角化细胞通透性；另一篇关于多发性硬化的研究指出,在多发性硬化患者脑脊液中生长抑素浓度较正常人较低,而给予生长抑素后可修复紧密连接蛋白ZO-1的表达,降低血脑屏障通透性,保护血脑屏障功能。另外生长抑素还可抑制肠上皮细胞凋亡,保护肠粘膜机械屏障。但目前尚无生长抑素对肠上皮细胞屏障功能及紧密连接作用的研究。本研究有以下目的：1.以Caco-2细胞为肠上皮屏障功能研究的体外模型,研究LPS对肠上皮紧密连接蛋白的影响；以IEC-6细胞为正常细胞模型,研究LPS对其增殖的影响；2.研究SST对LPS诱导后肠上皮细胞屏障功能的保护作用及可能机制；详细阐明SST对Caco2细胞屏障功能的影响,并进一步研究其对紧密连接蛋白表达及其分布变化的影响；初步探讨ERK-MAPK通路以及其特异性抑制剂在其中的作用；研究SST对IEC-6细胞增殖的影响；3.构建重症急性胰腺炎大鼠模型,观察SAP大鼠血清炎症因子的水平以及肠上皮紧密连接的破坏情况；观察和检测思他宁治疗后大鼠肠粘膜上皮形态、紧密连接结构和功能的变化,测定血液中肠黏膜通透性指标,证实SST对SAP大鼠的肠粘膜上皮紧密连接具有保护作用。材料与方法1.主要材料人结肠癌细胞Caco-2细胞和大鼠隐窝上皮细胞IEC-6(ATCC, Manassas,VA),生长抑素(Sigma,美国),思他宁(Stilamin, Merck Serono,德国),兔抗occludin抗体(abcam)、兔抗ZO-1抗体(Santa cruz)。Transwell小室及细胞培养板(Corning公司)。CCK-8试剂盒(日本同仁)、D-乳酸试剂盒(Biovision), TNF-α和IL-1β检测试剂盒(R&D公司,美国)。Wistar大鼠(南方医科大学实验动物中心)。2.方法2.1LPS对上皮细胞增殖作用的影响和对Caco2细胞紧密连接蛋白表达的影响使用CCK-8试剂盒检测不同浓度的LPS对肠上皮细胞Caco2口IEC-6细胞增殖的影响。分别加入0.1、1、10、50、100μg/ml的LPS,经培养24h后加入CCK8检测试剂,于细胞培养箱中再培养2h,在酶标仪上450nm (A450)处测定吸光度。采用人肠上皮细胞株Caco-2细胞建立肠屏障模型,经0.1-100μg/ml的不同浓度LPS处理24h后采用Western Blot技术检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达,观察不同浓度的LPS对紧密连接蛋白表达的影响。2.2生长抑素可抑制LPS的抗细胞增殖作用,并通过抑制ERK-MAPK通路的激活保护LPS诱导的Caco2细胞屏障功能大鼠隐窝上皮细胞株IEC-6细胞分别用1、10、100、1000nM的SST预处理,加或者不加LPS(100μg/ml),培养24h后加入CCK8检测试剂,于细胞培养箱中再培养2h,在酶标仪上450nm(A450)处测定吸光度。人肠上皮细胞株Caco-2细胞加入SST(lnM)或U0126(10μM)预孵育1h,再加入LPS(100μg/ml)培养24h。电阻仪测定单层跨膜电阻抗(TER)值,酶标仪测定单层细胞对FITC-dextran的通透性,采用Western Blot检测紧密连接蛋白(occludin和ZO-1)的表达水平。在SST和LPS作用时采用免疫荧光技术检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达和分布,并用Western Blot检测p-ERK和ERK蛋白的表达2.3生长抑素对重症急性胰腺炎大鼠肠上皮紧密连接的作用雄性Wistar大鼠72只,随机分为3组：假手术组(常规开腹仅翻转胰腺,不造模)、重症急性胰腺炎组(SAP组,5%牛黄胆酸钠0.1ml/100g逆行胆胰管注入)、生长抑素治疗组(在SAP造模后即给予思他宁治疗,以5μg/kg/h的剂量缓慢静脉注入生长抑素,每24h注射一次),每组分为3个时间点：6h、24h、48h,每个时间点每组8只大鼠。然后分别取大鼠血液、胰腺、肠道标本。测定血浆内D-乳酸含量、血炎症因子TNF-α和IL-1β水平,HE染色检测胰腺病理和回肠末端病理改变,用Western Blot和免疫荧光技术检测回肠末端紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达和分布,采用免疫组织化学法检测回肠末端肠粘膜上皮NF-κB的表达。2.4统计学分析所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示,数据分析采用SPSS13.0分析软件进行。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。计数资料采用卡方检验。p<0.05设定为差异具有显著性。结果1.LPS抑制IEC-6细胞增殖、下调Caco2细胞紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达。当使用0.1-100μg/ml的LPS刺激IEC-6细胞后,我们发现高浓度的LPS可抑制IEC-6细胞增殖,且呈浓度依赖性,随着浓度的增加抑制作用越明显。当LPS浓度小于50μg/ml时不能抑制其细胞增殖,增加浓度至50μg/ml和100μg/ml时,可显著抑制IEC-6细胞增殖(50μg/ml和100μg/ml时的OD值分别为1.136±0.062和0.893±0.049,与对照组相比p<0.05)。另外,我们观察到在0.1-100μg/ml浓度范围内,LPS并不能抑制Caco2细胞增殖。通过Western Blot检测Caco2细胞紧密连接蛋白表达,发现正常的Caco2细胞中紧密连接蛋白occludin和ZO-1呈高表达,随着LPS刺激浓度的增加,occludin和ZO-1的表达逐渐降低。1μg/ml的LPS作用时,occludin表达开始出现显著性降低,在100μg/ml时表达最低(0.034±0.006,与对照组相比p<0.001)；而ZO-1表达在0.1μg/ml的LPS作用时显著降低,在100μg/ml时最低(0.027±0.007,与对照组相比p<0.001)。2.SST改善LPS对IEC-6细胞增殖的抑制作用,且可通过抑制ERK-MAPK通路保护LPS诱导的Caco2细胞屏障功能1-1000nM的生长抑素单独作用于IEC-6细胞时不能影响其增殖。我们前期发现100μg/ml的LPS可显著抑制IEC-6细胞增殖,而在加入生长抑素(1、10、100nM)后发现,1nM的SST可显著改善LPS对IEC-6细胞增殖的抑制作用(0.680±0.043,与LPS单独处理组相比p<0.01),而10nM和100μM的SST不能改善其细胞增殖。经100μg/ml的LPS作用24h后可见Caco2细胞TER值明显下降(312.000±7.937Ohm· cm2,与对照组相比p<0.01),细胞对FITC-dextran透过率明显增加(0.0115±0.0008mg/ml,与对照组相比p<0.01)。在加入LPS前经1nM的SST预孵育1h后,可明显增加Caco2细胞TER值和降低FITC-dextran的通过,与LPS组相比均有统计学差异(TER值和FITC-dextran透过率分别为477.443±27.413和0.008±0.0006,与单独LPS处理组相比p<0.01)。前面我们通过Western Blot检测已经发现100μg/ml的LPS可显著下调Caco2细胞中紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达,1nM的SST预孵育1h可明显增加TJ蛋白occludin和ZO-1蛋白的表达(与LPS组相比p<0.01)。免疫荧光检查结果显示,100μg/ml的LPS刺激24h后,Caco2细胞TJ蛋白occludin、ZO-1在细胞膜上的表达密度降低,且分布不连续；1nM的SST预孵育后能够改善紧密连接蛋白在细胞膜上的分布,维持其分布的连续性和完整性,减少胞浆内分布,抑制LPS造成的紧密连接蛋白表达下降。此外,我们发现100μg/ml的LPS培养24h后可显著上调p-ERK的表达(p<0.05)。加入1nM的SST预孵育1h,可明显下调LPS引起的p-ERK的高表达。我们进一步研究MEK特异性抑制剂U0126在其中的作用。发现加入10μM的U0126预孵育1h后,LPS对Caco2细胞屏障功能的破坏作用显著减弱,表现为与单独LPS刺激相比,TER值增加和对FITC-dextran通过率降低(TER值和FITC-dextran透过率分别为424.667±15.535和0.007±0.0004,与单独LPS处理组相比p<0.001)；而紧密连接蛋白occludin和ZO-1表达也较单独LPS处理组显著上调(p<0.01)。3.生长抑素通过抑制NF-κB的激活保护重症急性胰腺炎大鼠肠上皮紧密连接我们首先通过胆胰管内逆行注射5%牛黄胆酸钠成功构建重症急性胰腺炎大鼠模型,并给予相应处理。三组大鼠在造模后6h、24h和48h三个时间点生存率上无明显统计学差异。分别于造模后6h、24h和48h取大鼠胰腺行HE检测,发现SAP组大鼠胰腺从造模后6h开始即可见明显水肿、充血、腺泡坏死,而对照组大鼠则仅有或无胰腺水肿。生长抑素治疗组从造模后6h开始大鼠胰腺病理改变如水肿、充血及坏死均较SAP组明显减轻,胰腺病理评分比较三组间在各个时间点存存在显著的统计学差异。我们取腹主动脉血检测肠道通透性指标D-乳酸以及炎症因子TNF-α和IL-1β水平。发现血D-乳酸在造模成功后的6h即明显增加,24h及48h升高水平不如6h明显,但与假手术组相比均有显著统计学差异(SAP组中3个时间点分别为10.228±2.633、6.236±1.779和8.049±0.704μmol/μl,与假手术组相比p<0.01)。而SST治疗组在治疗后48h可显著降低D-乳酸水平,与SAP组间有统计学差异(6.226±1.127,与SAP组相比p<0.05),但仍高于假手术组(p<0.01)。血炎症因子TNF-α和IL-1p水平在造模后6h开始升高,至48h时达到最高,在3个时间点均明显高于假手术组(TNF-α在SAP组中3个时间点分别为26.466±4.114、66.000±16.003和231.746±45.019, IL-1β在SAP组中3个时间点分别为42.912±3.367、71.036±14.241和169.744±23.981,与SO组相比均有p<0.01)；而SST治疗组可显著降低血TNF-α和IL-1β水平(TNF-α在SST治疗组中3个时间点分别为22.149±2.531、31.316±14.919和125.658±50.888,IL-1p在SST治疗组中3个时间点分别为26.885±4.491、38.271±9.682和65.849±49.252,p<0.05),但仍高于假手术组(p<0.05)。肠道组织HE染色结果显示,SAP大鼠肠黏膜绒毛结构紊乱、上皮细胞脱落,绒毛高度及隐窝深度均较SO组降低,两者间在三个时间点均具有统计学差异(p<0.01)；SST治疗后黏膜组织仅见充血及轻度水肿,上皮细胞排列整齐、脱落较少,绒毛结构较完整,且绒毛高度和隐窝深度较SAP组明显增加(p<0.01),而与SO组相比无明显差异。另外我们分别用免疫荧光和Western Blot检测各组大鼠造模后24h肠粘膜紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达。免疫荧光结果显示,SAP大鼠在24h时肠粘膜上皮细胞紧密连接蛋白表达明显下降,分布不连续,甚至大量缺失；思他宁治疗组紧密连接蛋白分布较连续、致密。Western blot结果显示,SAP大鼠紧密连接蛋白的表达下降,SST治疗后可以增加蛋白的表达,两者间有统计学差异(p<0.05)。免疫组织化学检测NF-κB表达显示,NF-κB在SO组有微弱的表达,SAP大鼠肠粘膜上皮NF-κB明显高表达,而经思他宁治疗后可显著降低其在肠粘膜上皮中的表达。结论1.LPS可下调Caco2细胞紧密连接蛋白表达,破坏Caco2细胞屏障功能；高浓度LPS能抑制正常上皮细胞IEC-6细胞增殖；2SST通过抑制ERK-MAPK通路的激活保护单层上皮细胞Caco2细胞紧密连接蛋白,改善LPS引起的细胞屏障功能的破坏,对肠黏膜屏障有一定的保护作用；SST还能促进LPS诱导的肠上皮细胞增殖、3.生长抑素类似物思他宁能明显改善SAP大鼠胰腺、减轻SAP大鼠炎症反应,并通过抑制SAP大鼠肠黏膜上皮NF-κB的激活减轻SAP大鼠肠粘膜损伤、改善胰腺炎引起的大鼠肠上皮紧密连接的表达、降低肠上皮通透性,从而保护SAP大鼠肠粘膜屏障功能。