【研究背景】据统计,我国平均每天有7,500人因癌症而死亡,仅2015年,我国约2,814,000人死于癌症。每年死于中枢神经系统恶性肿瘤的人数约为61,000,在所有肿瘤中排名第九。起源于神经上皮的胶质瘤约占脑恶性肿瘤的80%,是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤类型。在世界卫生组织(World Health Organization,WHO)中枢神经系统肿瘤分类中,胶质瘤被分为I、II、III和IV级。WHO I级胶质瘤往往呈局限性生长,仅通过手术就能够治愈。II、III和IV级的胶质瘤呈浸润性生长,鉴于中枢神经系统是生命中枢,不能像胃肠道等部位可以扩大切除,浸润性的胶质瘤往往不能完全切除,甚至不能手术。即使联合放疗、化疗,胶质瘤也常常复发,甚至演进为恶性程度更高的肿瘤。目前,胶质瘤的预后仍不容乐观,也有待于进一步研究,寻求新的治疗靶点。JMJD3编码组蛋白H3第27位赖氨酸特异性去甲基化酶,位于17p13.1,靠近抑癌基因TP53,提示可能在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。既往文献研究发现JMJD3在肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中表达上调,并发挥着原癌基因的作用;在滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤中表达下调,发挥着抑癌基因的作用,可见JMJD3在肿瘤中作用非常复杂,可能具有组织特异性。前期我们通过免疫组织化学染色发现JMJD3在胶质瘤中的表达低于正常脑组织,说明JMJD3在胶质瘤中的表达水平下调,提示JMJD3蛋白表达水平下调可能是胶质瘤发生和发展过程中重要的表观遗传学因素。然而,在胶质瘤中关于JMJD3的研究非常少,JMJD3在胶质瘤中的作用尚不明确。本研究对JMJD3下调在胶质瘤发生发展中的作用及机制做了初步探讨,从而为临床上胶质瘤的靶向治疗提供新的表观遗传学的理论基础。【目的】1.检测JMJD3蛋白在33种人正常组织中的表达水平,为进一步研究JMJD3功能奠定基础;2.探讨胶质瘤中JMJD3表达和临床病理特征及预后的关系;3.研究在胶质瘤复发过程中,JMJD3表达变化及胶质瘤分子分型相关的重要基因的改变,为探索JMJD3在胶质瘤复发中的作用奠定基础;4.研究JMJD3对胶质瘤的增殖、侵袭、迁移等恶性表型的影响,探索JMJD3在胶质瘤中的作用;5.研究JMJD3对胶质瘤细胞周期的影响,探讨JMJD3抑制肿瘤的作用机制;6.探索胶质瘤中JMJD3表达下调的可能机制。【方法】本研究采用了组织病理学、分子生物学、细胞生物学等研究方法,主要列举如下:1.利用免疫组织化学染色,检测33种人正常组织和152例胶质瘤肿瘤样本中JMJD3蛋白表达水平;2.在152例胶质瘤样本中,利用Kaplan–Meier法,分析JMJD3的表达与胶质瘤患者总生存期(Overall Survival,OS)之间的关系;利用Cox风险回归模型,分析JMJD3是否为星形细胞肿瘤(astrocytic tumors,ATs)及少突-星形胶质细胞肿瘤(oligoastrocytic tumors,OATs)患者OS独立的预后因素;利用Chi-Square检验分析ATs及OATs的临床病理特征与JMJD3表达水平之间的联系;3.利用免疫组织化学染色,检测47对原发性和复发性星形细胞肿瘤中JMJD3和相关蛋白(EZH2,H3K27me3)的表达水平;利用多聚酶链反应(polychain reaction,PCR)和Sanger测序技术,检测47对原发性和复发性星形细胞肿瘤中分子分型相关重要基因的突变;4.利用配对Chi-Square检验和一致性检验,分析肿瘤复发前后JMJD3和JMJD3相关蛋白表达水平的变化;同时分析星形细胞肿瘤分子分型相关基因的突变状态或蛋白表达水平的变化;5.在47对原发性和复发性星形细胞肿瘤样本中,利用Kaplan–Meier法和Cox风险回归模型分析JMJD3、JMJD3相关蛋白表达水平和星形细胞肿瘤分子分型相关基因的改变与星形细胞肿瘤患者无进展生存期(Progression-free Survial,PFS)之间的关系;6.应用Western Blot检测胶质瘤细胞系(U87、U251和Hs683)中JMJD3的蛋白表达水平;7.应用慢病毒感染技术在胶质瘤细胞系U87和U251中过表达JMJD3,应用实时定量多聚酶链反应(quantitive real-time PCR,q RT-PCR)和Western Blot检测U87和U251细胞中JMJD3的m RNA和蛋白表达情况;8.利用Transwell技术,检测JMJD3表达水平对胶质瘤细胞(U87和U251)迁移和侵袭能力的影响;应用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和平板克隆实验,检测JMJD3表达水平对胶质瘤细胞增殖能力的影响;利用流式细胞仪检测JMJD3表达水平对U87细胞周期的影响;9.利用甲基特异性多聚酶链反应(mathylation-specific PCR,MS-PCR)检测胶质瘤中JMJD3启动子甲基化水平。【结果】1.在组织芯片涵盖的33种人正常组织中,有15种正常组织表达JMJD3。仅在大脑组织中JMJD3强阳性;在淋巴结、结肠粘膜上皮、肝脏、涎腺导管上皮、胰腺、胃粘膜上皮、胸腺、扁桃体、睾丸、肺脏、小肠粘膜上皮、脾脏、食管和皮肤的鳞状上皮等14种正常组织弱阳性,而其余18种组织包括肾上腺、卵巢、甲状腺、乳腺、骨髓、心肌、前列腺、子宫内膜等未见明确JMJD3阳性。2.在152例胶质瘤中,共29例样本JMJD3阳性,低级别(WHOⅠ和Ⅱ级)胶质瘤中17例阳性(17/63,26.98%),高级别(WHOⅢ和Ⅳ级)胶质瘤中12例阳性(12/89,13.48%),两组JMJD3阳性率差异具有统计学意义(p=0.037);ATs和OATs共计107例,其中JMJD3阳性24例,阳性率为22.43%(24/107)。少突胶质细胞肿瘤(Oligodendroglial tumours,OTs)45例,其中JMJD3阳性病例为5例,阳性率为11.11%(5/45)。JMJD3阳性率在ATs和OATs中较OTs中稍高,但是差异不具有显著性(p>0.05)。3.107例ATs和OATs标本中,JMJD3的表达与患者的年龄、IDH1有无突变均无明显相关性(p>0.05),但其阳性率随肿瘤的分级(p=0.021)和增殖指数(p=0.045)的升高而显著降低。4.单因素分析结果表明,JMJD3阳性的胶质瘤患者总体生存期较长(p=0.006);COX多因素生存分析结果表明JMJD3表达是ATs和OATs患者OS独立的预后因子(p=0.031)。5.在47对原发性和复发性星形细胞肿瘤中,利用配对卡方检验和一致性检验发现,星形细胞肿瘤关键分子—IDH1、TP53和TERTp突变状态在肿瘤复发前后高度一致;O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)和X连锁α-地中海贫血/精神发育迟滞(alpha-thalassemia/mental retardation,X-linked,ATRX)的表达水平在肿瘤复发前后保持中等程度的一致;而JMJD3、EZH2和H3K27me3在肿瘤复发前后表达水平虽然不具有显著性差异(p>0.05),但是一致性比较低。6.单因素生存分析发现,47例星形细胞肿瘤的JMJD3、EZH2、MGMT、ATRX表达水平和IDH1、TERTp突变状态及WHO分级、年龄、Ki67增殖指数均与患者的PFS相关(p<0.05),而性别、H3K27me3表达水平及TP53突变状态和患者的PFS无相关性(p>0.05)。多因素分析发现JMJD3不是星形细胞肿瘤患者PFS独立的预后因子;而IDH1、MGMT和Ki67是星形细胞肿瘤患者PFS独立的预后因子。IDH1、MGMT和Ki67三者组合在一起,将IDH1野生组患者再细分为两组进行生存分析,发现同时伴有MGMT丢失和低Ki67增殖指数的IDH1野生型星形细胞肿瘤患者的PFS较其他的IDH1野生型星形细胞肿瘤患者的PFS显著延长。7.Western Blot结果显示,胶质瘤细胞系U251、U87和Hs683中内源性JMJD3蛋白表达水平低。8.Transwell实验结果显示,不论是侵袭的细胞数,还是迁移的细胞数,过表达JMJD3的U87和U251细胞均较对照组的细胞数目明显减少(P<0.05)。CCK-8显示过表达JMJD3的U87和U251细胞,增殖能力比对照组均明显降低(P<0.05);平板克隆实验显示过表达JMJD3的U87和U251细胞,形成的克隆数比对照组均明显减少(P<0.05)。9.转染了人JMJD3的U87细胞和转染空载体Plvx的U87细胞相比较,G0/G1期肿瘤细胞的比例显著增加(66.21±2.27 vs 57.14±1.17,P=0.024),S期肿瘤细胞的比例与G0/G1期相反,呈显著降低(17.18±0.49 vs 25.75±1.45,P=0.005),而G2/M期肿瘤细胞的比例未发现明显差异(16.17±0.95 vs 16.59±0.77,P=0.75)。10.利用MS-PCR检测JMJD3启动子甲基化情况,发现启动子甲基化和JMJD3的蛋白表达水平之间一致性不高。【结论】1.研究了JMJD3在人胶质瘤中的表达情况;发现JMJD3表达水平随胶质瘤的级别和增殖指数升高而降低;2.JMJD3表达可以作为ATs和OATs患者OS的独立预后因子;3.JMJD3、EZH2和H3K27me3表达水平在肿瘤复发前后一致性低,提示随着肿瘤的复发和进展,JMJD3的表达水平发生变化。4.IDH1、TP53、TERTp在肿瘤复发前后的突变状态高度一致,说明其是胶质瘤发生的早期事件。MGMT和ATRX的表达水平在肿瘤复发前后保持中等程度的一致。5.JMJD3过表达可以抑制胶质瘤细胞系的细胞侵袭、迁移和增殖能力,提示其可能在胶质瘤复发和恶性进展的过程中发挥着重要的作用。6.过表达JMJD3的U87细胞的G0/G1期的肿瘤细胞比例显著增加,而S期的肿瘤细胞比例显著降低,G2-M期的肿瘤细胞比例没有统计学差异,提示过表达JMJD3可导致U87细胞G0/G1细胞周期阻滞。7.启动子甲基化是导致部分胶质瘤JMJD3蛋白表达下调的重要原因之一,但可能还存在其它的调控机制。综上,本研究证实JMJD3在胶质瘤中发挥抑癌基因的功能,并对其表达下调的可能机制进行了初步探讨。