目的:随着现代医学的发展,目前,骨科临床治疗水平有了长足进步,很多骨科疾病可以治愈,但是某些疾病,如骨折不愈合、骨质疏松症、股骨头坏死、骨缺损,仍然需要找到新的治疗手段,以期进一步提高临床治疗水平。骨髓间充质干细胞的发现和应用,为临床提供新的思路。骨折部位血管再生是骨痂形成的前提,在血管再生过程中,血管再生相关基因起重要的作用;骨痂的形成还需要骨痂形成的种子细胞,即成骨细胞,骨髓间充质干细胞的成骨分化是成骨细胞的主要来源,目前骨髓间充质干细胞的成骨分化已取得很大进展,活化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径参与骨髓间充质干细胞的成骨分化过程。成骨生长肽(OGP)是一种成骨生长因子,近十年研究较多,通过研究成骨生长肽诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中血管再生相关基因Angptl4、Fbln5、VEGFA表达变化与MAPK途径的关系,阐明OGP促进骨髓间充质干细胞的成骨分化的机理,为临床应用OGP治疗骨质疏松症及及促进骨折愈合奠定理论基础。共包括四个实验:实验一,大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养,通过该实验掌握大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养的条件;实验二,OGP诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,通过这一实验,验证OGP对骨髓间充质干细胞的成骨诱导作用,并找到OGP成骨诱导作用的最佳浓度;实验三,胎牛血清对成骨生长肽促进骨髓间充质干细胞增殖分化的影响,通过这一实验,找到最佳的胎牛血清浓度;实验四,MAPK途径血在OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中血管再生相关基因表达变化中的作用,通过这个实验,观察在OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中血管再生相关基因(Angptl4、Fbln5、VEGF)表达变化和MAPK途径的关系。方法:实验一:采用全骨髓贴壁培养法培养大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态。实验二:将实验一中P3代骨髓多能干细胞,分为六组:即对照组、10-10mol/LOGP组、10-9mol/LOGP组、10-8mol/L OGP组、10-7mol/L OGP组。对照组使用不含血清的DEEM培养基,各种浓度的OGP组在不含血清的DEEM培养基中加入相应浓度的OGP。连续培养12天。用倒置相差显微镜观察成骨细胞形态,钙钴法碱性磷酸酶染色,钙结节茜素红染色进行成骨细胞鉴定。MTT检测各组光吸收度值(OD值),观察各组间OD值差异。实验三:MTT噻唑蓝比色法测定不同条件下BMSCs的增殖:取第二代以后形状典型的BMSCs以1×105/m L的密度用含10%FBS的完全培养基分别接种于6块无菌96孔板中,细胞周期同步开始进行后续分组实验。每块板承载六组,分别为OGP10-10mol/L组、OGP10-9mol/L组、OGP10-8mol/L组和不加任何药物的对照组,每组细胞同时设FBS浓度为0、2%、5%、8%和10%五个梯度,每组三个复孔,每3d换液一次。1d、3d、5d、7d、9d、12d采用MTT法检测细胞的增殖率。每孔直接加入10u L的MTT,放回培养箱中原条件孵育4h。之后弃去上清,每孔加入100u L的10%的SDS,37℃过夜培养。酶标仪检测各孔570nm吸光度,记录分析各组光吸收值。p NPP法测定细胞内碱性磷酸酶的活性:将第二代以后形状典型的BMSCs以1×105/ml的密度接种于六孔板中,细胞完全贴壁后,将培养液换成不含血清的基础培养基,培养12h,此时细胞周期同步。开始进行后续分组实验。实验组为:OGP10-10mol/L组、OGP10-9mol/L组和OGP10-8mol/L组,未加OGP的为对照组,每组细胞同时设FBS浓度含量5%、8%和10%三个梯度,各组细胞均设6个复孔,每3d换液一次,在第9d刮取细胞,4000rpm/min离心收集到1.5m L的离心管中进行碱性磷酸酶活性检测。观察各组差异。实验四:将P3代骨髓多能干细胞,分为:(1)对照组(OGP诱导)组;(2)OGP+U0126组;(3)OGP+SP600125组;(4)OGP+SB203580组;(5)OGP+U0126+SP600125+SB203580组,共5组,各分组在无血清的DEEM培养基中培养24小时,待细胞周期同期化后,2至4组分别加入相应浓度的不同MAPK通路抑制剂,5组加入2至4组所用各通路抑制剂浓度预处理30分钟后,然后加入10-8mol/L OGP,培养板置于370C,5%CO2培养箱中继续培养。连续培养3天。同时取各组上清液和细胞进行指标检测。RT-PCR检测c-myc、c-jun、atf-2、Angptl4、Fbln5、VEGF、Cbfa1m RNA的表达,western-blot(蛋白印迹法)检测Angptl4、Fbln5、VEGF的表达,观察表达量的差异。结果实验一在倒置显微镜下,刚刚分离取到的骨髓间充质干细胞细胞形态比较均匀一致,多为圆形,细胞体透亮,大小不一,混杂有其他杂细胞,24h半量换液后,可见细胞贴壁,呈圆形或多角形,48h后全量换液时,可见大量细胞贴壁,72h后贴壁细胞继续增加,细胞形态逐渐均一,呈短梭形,随着时间延长,细胞呈梭形或纺锤形,逐渐融合成片,呈漩涡状分布。具有典型的骨髓间充质干细胞的特点。实验二倒置相差显微镜下细胞的形态呈梭形或纺锤形,呈现成纤维细胞的形态,分布均匀。细胞融合成片,可呈铺路石样变化,具有典型的成骨细胞形态,钴法碱性磷酸酶染色可见黑色颗粒,钙结节茜素红染色橙红色,证明培养的细胞为成骨细胞。MTT检测示培养基中OGP的浓度在10-8mmol/l,培养12天时,光吸收度值最高。实验三MTT检测表明,FBS浓度越低,细胞增殖越慢。当FBS浓度为0时培养液加入OGP仅能短时微弱促进BMSCs增殖。当FBS浓度为2%时培养液加入OGP显示10-8mol/L组与其它组相比明显但是短暂促进BMSCs增殖,但是最终由于细胞缺乏营养因子生长进入平台期并且开始凋亡。当FBS浓度为5%时各组细胞均出现增殖,并且以OGP10-8mol/L组促增殖效果明显大于OGP10-9mol/L组(P<0.05),随着培养时间延长至9d,部分细胞增殖减慢。当FBS浓度为8%时各组细胞增殖差异更加明显(P<0.01),OGP10-8mol/L组促增殖效果依然大于OGP10-9mol/L组,对照组和OGP10-10mol/L组无差异(P>0.05)。当FBS浓度为10%时OGP10-10mol/L组促增殖效果低于对照组,OGP10-9mol/L组和OGP10-8mol/L组差异缩小,其差异无统计学意义(P>0.05),OGP10-8mol/L组不再表现其促增殖的优势。碱性磷酸酶活性结果显示:三种FBS浓度的对照组之间相比差异具有统计学意义(P<0.05),说明随着培养系统中血清含量的增加,ALP的产生也相应变化,FBS浓度可以影响BMSCs的成骨分化。各组OGP浓度随着FBS浓度的增大ALP的产量也显著增加(P<0.05),说明FBS通过诱导BMSCs增殖从而增加了成骨分化的细胞数量。值得关注的是8%FBS浓度组OGP10-8mol/L组显著高于OGP10-9mol/L组,但是10%FBS浓度组OGP10-8mol/L组与OGP10-9mol/L组相比无统计学意义(P>0.05),说明10%FBS干扰了OGP的促分化作用。综上所述:我们认为8%FBS的培养条件比较有利于检测OGP诱导BMSCs的增殖和成骨分化,为后续进一步探讨OGP诱导BMSCs的增殖和成骨分化的信号机制奠定了科学合理的培养条件。实验四MAPK的主要通路ERK1/2、JNK、P38信号传导通路均参与OGP促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程。Angptl4、Fbln5、VEGFA在OGP促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程均有表达。c-myc在骨髓间充质干细胞成骨分化的0天、1天、3天、5天、7天均表达;c-jun在骨髓间充质干细胞成骨分化的0天、1天、3天、5天、7天、9天均表达;atf-2在骨髓间充质干细胞成骨分化的7天、9天表达;VEGF在骨髓间充质干细胞成骨分化的1天、3天、5天均表达;Fbln5在骨髓间充质干细胞成骨分化的第7天表达;Angptl4在骨髓间充质干细胞成骨分化的1天、3天、5天、7天均表达;Cbfa1在骨髓间充质干细胞成骨分化的0天、1天、3天、5天、7天、9天均未见表达。因而加抑制剂各组选择在骨髓间充质干细胞成骨诱导第7天检测c-jun、c-myc、atf-2;选择在骨髓间充质干细胞成骨诱导第5天检测VEGF、Angptl4。第2组(10-8mol/LOGP+U组)不表达c-myc,说明ERK1/2通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程;第3组(10-8mol/LOGP+SP)组不表达c-jun,说明JNK通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程;第4组(10-8mol/L OGP+SB)组不表达atf-2,说明P38通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程;各组均表达VEGF,但是第3组表达量比对照组增加,第2组、第5组表达量比对照组下降,这说明ERK1/2途径参与骨髓间充质干细胞成骨分化过程,不仅该途径参与VEGF的表达,还有其他途径参加;各组均表达Fbln5,但是第4组和第5组表达量比对照组下降,这说明P38通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程,该通路参与Fbln5的表达;各组均表达Angptl4,但是第3组和第5组表达量比对照组下降,说明JNK通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程,该通路参与Angptl4的表达;western-blot检测结果证实随着VEGF、Angptl4、Fbln5m RNA表达的变化,VEGF、Angptl4、Fbln5蛋白相应变化。结论1、OGP浓度选择10-8mmol/L、8%FBS的培养条件比较有利于OGP诱导BMSCs的增殖和成骨分化。2、MAPK信号传导通路的主要通路:ERK1/2、P38、JNK通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程;P38通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程,该通路参与Fbln5的表达;JNK通路参与OGP诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程,该通路参与Angptl4的表达;ERK1/2途径参与骨髓间充质干细胞成骨分化过程,不仅该途径参与VEGF的表达,还有其他途径参加;western-blot检测结果证实随着VEGF、Angptl4、Fbln5m RNA表达的变化,VEGF、Angptl4、Fbln5蛋白相应变化。说明:MAPK信号传导途径参与OGP诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化,并参与成骨分化过程中血管再生相关基因Angptl4、Fbln5、VEGF表达变化。