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杜氏/贝氏肌营养不良症（Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD）可分为两种类型，即DMD和BMD。DMD这是最常见致死性的X-连锁隐性遗传性肌病，以进行性肌萎缩无力伴小腿腓肠肌假性肥大为主要典型临床特征。其发病率在活产男婴为1/3500，多在3-5岁发病，在20岁左右死亡。BMD群体发病约为1/18000，临床特征与DMD相似，但病情较轻。DMD基因定位在Xp21.2上，长2.4Mb，至少含有79个外显子，是目前已知最大的人类基因，包含有8个独立的组织特异性启动子。约75%DMD患者存在一个或多个外显子大片段缺失或重复，剩余约25%被认为存在微小突变，包括点突变、小的插入缺失、复杂的微小重排等。在多数情况下，微小突变会导致翻译的提前终止，形成功能不全的截短蛋白，从而引起疾病的发生。本研究的第一部分将多重连接依赖性探针扩增技术（multiplex ligation-dependentprobe amplification，MLPA）应用于DMD/BMD的分子诊断。对来自18个家庭临床上怀疑为DMD的患者进行了MLPA分析，在6个患者的DMD基因中检测出1至多个外显子缺失（其中2例为新生突变），1例为外显子重复突变。本研究的第二部分应用MLPA对两个DMD高风险的孕妇进行了产前分子诊断，结果在其中一个胎儿的DMD基因中检测到与先证者一样的缺失突变，而另一个未测到与先证者一样的突变。本研究的第三部分建立了一个检测DMD基因微小突变的分子诊断体系。对一具有典型DMD/BMD的临床表现，但MLPA未检测到DMD基因外显子缺失（或重复）的患者，利用第二代测序技术，对其外显子组进行序列测定。在其DMD基因上发现一个突变：X31950196C/G，并通过Sanger测序法验证了这一突变。该突变位于DMD基因的关键剪接供体位点上，可能会影响所在内含子的识别和剪接。通过生物信息学工具对这突变进行预测，发现该突变点所在的5’端剪接供体位点失效了，并可能导致剪接方式的改变。为进一步研究这一突变的致病机制，我们利用杂种小基因剪接试验（hybridminigene splicing assay，HMSA），从细胞水平上分析病人和正常人DMD基因中该突变相关位置可变剪接的变化情况。将与该突变相关的侧翼序列插入到pcDNATM3.1/Hygro（+）载体中，并瞬时转染HeLa细胞，取其总RNA，采用RT-PCR技术分析可变剪接产物的表达情况。与正常对照相比，RT-PCR产物的序列测定显示：病人由于突变导致其剪接位点散失，产生两种转录产物：一种是相应内含子保留，为主要产物；另外一种利用相应替代性剪接供体位点。这两种情况与在生物信息学预测的结果相符。两种转录产物在翻译时其相应肽链C端氨基酸序列有所改变、终止密码提前出现,不能形成具有功能的蛋白质。