第一部分七氟醚预处理联合后处理对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的影响　　 目的：探讨七氟醚预处理联合后处理对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的影响。　　 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，体重250～280g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为5组(n=10）：假手术组（S组）、缺血再灌注组(I/R组)、七氟醚预处理组（Spre组）、七氟醚后处理组（Spo组）和七氟醚预处理联合后处理组（Spre+po组）。S组大鼠冠状动脉只穿线不结扎；I/R组采用结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h的方法制备大鼠心肌缺血再灌注模型，术中吸入2L/min纯氧，缺血前后及再灌注前后不再给予其他干预；Spre组缺血前30min吸入2.5％七氟醚15min，洗脱15min，结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h；Spo组大鼠再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h。Spre+po组大鼠于缺血前30min吸入2.5％七氟醚15min，洗脱15min，结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h。　　 分别于左冠状动脉前降支穿线并稳定10min(T0)、缺血30min(T1)、再灌注5min(T2)、10min(T3)、1h(T4)、2h(T5)时记录平均动脉压(MAP)和心率(HR)。分别于左冠状动脉前降支穿线并稳定10min(preischemia)、再灌注2h末测定左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVDEP)、左室内压上升/下降的最大速率(±dp/dtmax)，计算左室发展压(LVDP=LVSP-LVDEP)。于再灌注2h时经左颈动脉取血，采用比色法检测血清血清乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性，双向侧流免疫法测定心肌肌钙蛋白I(cTnI)浓度。每组随机取5只大鼠测定心肌缺血区体积和梗死区体积。每组取剩余5只大鼠处死取心脏，透射电镜下观察心肌超微结构并行线粒体损伤评分。　　 结果：　　 1．各组大鼠HR的比较各组大鼠T0时HR比较差异无统计学意义(P＞0.05)；与S组比较，其余各组T1～T5时HR降低（P＜0.05），MAP降低(P＜0.05)；与I/R组比较，Spre组、Spo组与Spo+pre组T3、T5时HR降低(P＜0.05)，T3～T5时MAP升高(P＜0.05)；Spre组、Spo组和Spo+pre组HR比较差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 2．各组大鼠LVDP、±dp/dtmax的比较各组preischemia LVDP、±dp/dtmax比较差异无统计学意义；与S组比较，I/R组LVDP、±dp/dtmax降低；与I/R组比较，Spre组、Spo组LVDP、±dp/dtmax升高；与Spre组、Spo组比较，Spo+pre组LVDP、±dp/dtmax升高。除S组外，各组组内与preischemia比较，LVDP、±dp/dtmax降低。　　 3．各组间血清LDH和CK-MB的活性及cTnI浓度的比较与S组比较，I/R组血清LDH和CK-MB的活性及cTnI浓度升高(P＜0.05或0.01)；与I/R组比较，Spre组和Spo组血清LDH和CK-MB的活性及cTnI浓度降低(P＜0.05或0.01)；与Spre组和Spo组比较，Spre+po组血清LDH和CK-MB的活性及cTnI浓度降低（P＜0.05）。　　 4．各组大鼠心肌梗死区体积的比较各组缺血区体积差异无统计学意义(P＞0.05)，与I/R组比较，Spre组、Spo组与Spre+po组心肌梗死区体积减小(P＜0.05或0.01)，与Spre组和Spo组比较，Spre+po组心肌梗死区体积减小(P＜0.05)。　　 5．心肌超微结构的变化 S组肌原纤维间排列整齐，线粒体膜完整，线粒体嵴部分清晰，结构完整；I/R组肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀明显，线粒体膜不完整，线粒体嵴消失；Spre组肌原纤维间水肿，线粒体膜完整，线粒体嵴部分消失；Spo组肌原纤维间水肿，线粒体膜完整，线粒体中度水肿，线粒体嵴部分消失；Spre+po组肌原纤维间水肿，线粒体局部轻度水肿，线粒体膜完整，线粒体嵴部分消失。　　 与S组比较，I/R组线粒体损伤评分升高，比表面和面数密度降低（P＜0.01）；与I/R组比较，Spre组和Spo组线粒体损伤评分降低，比表面和面数密度升高(P＜0.05或0.01)；与Spre组和Spo组比较，Spre+po组线粒体损伤评分降低，比表面和面数密度升高（P＜0.05）。　　 结论：七氟醚预处理联合后处理较单独处理减轻心肌缺血再灌注损伤的作用增强。　　 第二部分七氟醚预处理联合后处理减轻大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的相关机制　　 目的：探讨七氟醚预处理联合后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制。　　 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，体重250～280g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为5组（n=10）。假手术组（S组）大鼠冠脉只穿线不结扎；缺血再灌注组(I/R组)结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h制备大鼠心肌缺血再灌注模型，术中吸入2L/min纯氧，缺血前后及再灌注前后不再给予其他干预；七氟醚预处理组（Spre组）缺血前30min，吸入2.5％七氟醚15min，洗脱15min，余处理同I/R组；七氟醚后处理组（Spo组）大鼠再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h，余处理同I/R组。七氟醚预处理联合后处理组（Spre+po组）缺血前30min，吸入2.5％七氟醚15min，洗脱15min，结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h。　　 于再灌注2h时测定血清氧化物岐化酶(SOD)活性、心肌丙二醛(MDA)含量，血浆血小板最大聚集率、血栓素B2(TXB2)和6-keto-PGF1α的浓度，计算TXB2/6-keto-PGF1α;测定缺血区心肌组织MDA含量、SOD及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性；测定缺血区心肌细胞凋亡指数，采用免疫组化和原位杂交的方法测定凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白和mRNA的表达。　　 结果：　　 1．与S组比较，I/R组血清及心肌组织SOD活性降低（P＜0.01），血清MDA浓度及心肌组织MDA含量升高（P＜0.05）；与I/R组比较，Spre组、Spo组及Spre+po组血清SOD浓度及心肌组织SOD活性升高(P＜0.05)，血清MDA浓度及心肌组织MDA含量降低(P＜0.05)；与Spre组和Spo组比较，Spre+po组血清SOD浓度及心肌组织SOD活性升高(P＜0.05)，血清MDA浓度及心肌组织MDA含量降低（P＜0.05）；Spre组及Spo组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。　　 2．与S组比较，I/R组心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低；与I/R组比较，Spo、Spre组及Spre+po组心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P＜0.05)；与Spre组和Spo组比较，Spre+po组心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P＜0.05)，Spre组及Spo组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 3．各组间血浆TXB2、6-keto-PGF1α浓度、TXB2/6-keto-PGF1α及血小板最大聚集率的比较与S组比较，I/R组TXB2、6-keto-PGF1α的水平、TXB2/6-keto-PGF1α和血小板最大聚集率升高(P＜0.05或0.01)；与I/R组比较，Spre组和Spo组TXB2/6-keto-PGF1α降低(P＜0.05或0.01)，6-keto-PGF1α的水平升高(P＜0.05或0.01)；与Spre组和Spo组比较，Spre+po组血浆TXB2、TXB2/6-keto-PGF1α和血小板最大聚集率降低(P＜0.05)，6-keto-PGF1α的水平升高(P＜0.05)。　　 4．与S组比较，I/R组心肌细胞凋亡指数升高，Bcl-2蛋白、Bax蛋白及Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均上调(P＜0.05)；与I/R组比较，Spo组、Spre组及Spre+po组心肌细胞凋亡指数降低，Bax蛋白及Bax mRNA表达下调(P＜0.05)，Bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA表达上调(P＜0.05)，Bcl-2/Bax升高(P＜0.05)。与Spre组和Spo组比较，Spre+po组凋亡指数降低，Bax蛋白及Bax mRNA表达下调(P＜0.05)，Bcl-2蛋白及Bcl-2mRNA表达上调(P＜0.05)，Bcl-2/Bax升高(P＜0.05)。Spo组、Spre组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 结论：　　 1．七氟醚预处理联合后处理可通过提高SOD活性，清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。　　 2．七氟醚预处理联合后处理能提高心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。　　 3．七氟醚预处理联合后处理可抑制TXA2的释放和促进PGI2的合成，从而减轻了大鼠心肌缺血再灌注损伤。　　 4．七氟醚预处理联合后处理通过上调Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，从而改善了Bcl-2/Bax，抑制了心肌细胞的凋亡，进一步减轻了心肌缺血再灌注损伤。　　 第三部分 PI3K-Akt-eNOS转导途径在七氟醚后处理减轻大鼠急性心肌缺血再灌注损伤中的作用　　 目的：评价PI3K-Akt-eNOS转导途径在七氟醚后处理减轻大鼠急性心肌缺血再灌注损伤中的作用。　　 方法：健康雄性Wistar大鼠75只，体重250～280g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为5组（n=15）。(1)假手术组(S)颈部切开，气管插管，开胸，左冠状动脉前降支下穿线，不结扎。(2)缺血再灌注组(I/R)结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h制备大鼠心肌缺血再灌注模型，缺血前后及再灌注前后不再给予其他干预。(3)七氟醚后处理组(Spo组)制备大鼠心肌缺血再灌注模型，再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min。(4)七氟醚后处理联合LY294002组(Spo+LY组)LY294002是选择性的PI3K抑制剂，制备大鼠心肌缺血再灌注模型，由另一术者于再灌注前5min经大鼠股静脉给药LY294002(0.3mg/kg)。再灌注前1min给予2.5％七氟醚持续吸入5min，(5)七氟醚后处理联合DMSO组(Spo+DMSO组)制备大鼠心肌缺血再灌注模型，再灌注前5min经大鼠股静脉给药给予0.02％DMSO(与Spo+LY组等容积)，不含有LY294002，再灌注前1min给予2.5％七氟醚持续吸入5min。分别于左冠状动脉前降支穿线并稳定10min(preischemia)、再灌注2h末测定左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVDEP)、左室内压上升/下降的最大速率(±dp/dtmax)，计算左室发展压(LVDP=LVSP-LVDEP)。再灌注2h后，测定血清磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性及心肌肌钙蛋白I(cTnI)的浓度。每组随机取5只大鼠的左室心肌组织，计算缺血危险区体积和梗死区体积占左室体积百分比。再灌注15min时，取缺血危险区心肌组织，采用Western Blot法测定Akt、eNOS蛋白表达及其磷酸化水平。　　 结果：　　 1．各组大鼠LVDP、±dp/dtmax的比较各组preischemia LVDP、±dp/dtmax比较差异无统计学意义；与S组比较，I/R组LVDP、±dp/dtmax降低；与I/R组比较，Spo组、Spo+DMSO组LVDP、±dp/dtmax升高；与Spo组比较，Spo+LY组LVDP、±dp/dtmax降低。除S组外，各组组内与preischemia比较，LVDP、±dp/dtmax降低。　　 2．各组间血清CK-MB和LDH活性及cTnI浓度的比较与S组比较，I/R组血清CK-MB和LDH活性及cTnI浓度升高(P＜0.05或0.01)；与I/R组比较，Spo组血清CK-MB和LDH活性及cTnI浓度降低(P＜0.05或0.01)，Spo+LY组血清CK-MB和LDH活性及cTnI的浓度差异无统计学意义(P＞0.05)；与Spo组比较，Spo+LY组血清CK-MB和LDH活性及cTnI浓度升高(P＜0.01)。　　 3．各组大鼠心肌梗死区体积的比较各组相比缺血区体积差异无统计学意义(P＞0.05)。与I/R组相比，Spo组心肌梗死区体积明显减小(P＜0.05)；Spo+LY组心肌梗死区体积差异无统计学意义（P＞0.05）；与Spo组比较，Spo+LY组心肌梗死区体积增加(P＜0.05)；Spo+LY组与I/R组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。　　 4．任两组间总Akt(t-Akt)及eNOS水平差异无统计学意义(P＞0.05)。与I/R组比较，Spo组p-Akt和其下游p-eNOS水平显著增加（p-Akt/t-Akt:Spo.vs.I/R:0.69±0.04vs.0.35±0.03,P＜0.05;p-eNOS/t-eNOS Spo.vs.I/R:0.73±0.03vs.0.54±0.01，P＜0.05）。给予LY294002后可阻断Akt及eNOS磷酸化(p-Akt/t-Akt:Spo.vs.LY:0.69±0.04vs.0.41±0.02，P＜0.05;p-eNOS/eNOSSpo.vs.LY:0.73±0.03vs0.58±0.02，P＜0.05)。Spo+LY组与I/R组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。　　 结论：PI3K-Akt-eNOS信号转导通路的激活可能是七氟醚后处理减轻大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的机制之一。