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1.研究背景和目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床常见的危重症,虽然已经对ALI/ARDS进行了长期的研究,但目前仍缺乏有效的治疗手段,病死率仍高达30~40%。ALI/ARDS的发生、发展是全身失控性炎症反应的结果,病理特征包括中性粒细胞聚集,肺泡-毛细血管的损伤和通透性增加,肺内大量蛋白和炎症因子渗出。线粒体在肺泡上皮损伤中发挥着重要作用,参与了细胞凋亡信号通路,如调节活性氧生成、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)平衡,稳定线粒体膜电位,或控制钙稳态。此外,研究表明,线粒体和炎症反应的相互作用在炎症性疾病中占有重要地位,但两者在急性肺损伤发病机制中的作用尚不清楚。解偶联蛋白(Uncoupling proteins,UCPs)是位于线粒体内膜的阴离子质子转运蛋白家族的成员,调控免疫应答和炎症反应,目前在人类中共发现5种亚型,分别命名为UCP1~5,其中UCP2是研究得较早较多的解偶联蛋白,目前发现UCP2在心脏、脑、肝脏等器官的炎症损伤中发挥了重要作用。已有文献报道在系统性炎症和感染的患者体内UCP2表达增加,与患者的死亡率存在相关性。急性肺损伤是全身失控性炎症反应的结果,因此UCP2可能成为急性肺损伤治疗的潜在靶点。但UCP2在急性肺损伤中的作用尚未见文献报道,本研究探讨了UCP2在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型炎症损伤中的作用及机制。本研究构建了过表达UCP2的腺病毒载体,体内转染C57BL/6小鼠,上调小鼠肺组织UCP2的表达;通过京尼平下调UCP2的表达。在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中,通过Western Blot(WB)、免疫组化检测腺病毒在小鼠肺组织中UCP2的表达情况;观察UCP2对肺组织病理改变和肺泡-毛细血管屏障通透性、细胞因子、细胞凋亡的影响;线粒体功能的改变;MAPK、NF-κB通路的激活情况,探讨UCP2在ALI/ARDS发生、发展中的作用,为ALI/ARDS的防治提供新的靶点和方向。2.研究方法:(1)ucp2过表达慢病毒载体的构建分离小鼠外周血单个核细胞提取总rna,rt-pcr扩增小鼠ucp2cdna,将其亚克隆至病毒穿梭载体pyr-adshuttle-1进行dna测序鉴定,并转染hek293细胞进行病毒包装,获得重组腺病毒ucp2-ad。用经鼻滴注建立c57bl/6j小鼠腺病毒ucp2-ad体内感染模型,同时使用空病毒载体ucp2-nc作为阴性对照,通过免疫组化、westernblot检测ucp2在肺组织的表达情况。(2)观察ucp2对急性肺损伤小鼠炎症损伤的影响腺病毒转染后第3d腹腔注射lps(15mg/kg)建立急性肺损伤小鼠模型。lps处理前使用京尼平预处理,抑制肺组织ucp2的表达。ali后24h处死小鼠,检测小鼠肺组织病理改变、肺水肿程度、支气管肺泡灌洗液中炎症因子含量,探讨ucp2对肺组织炎症损伤的影响;通过westernblot检测cleavedcaspase3表达、细胞色素c的释放和bcl-2家族蛋白在各组小鼠肺组织的表达,tunel检测肺泡细胞凋亡情况,探讨ucp2对肺泡上皮细胞凋亡的影响。(3)观察ucp2对急性肺损伤后mapk和nf-κb通路的影响进一步观察ucp2对急性肺损伤后促分裂原活化蛋白激酶(mapk)通路的影响,通过westernblot检测p38mapk、jun氨基末端激酶(junn-terminalkinase,jnk)、细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)的激活情况,elisa检测炎症因子的水平,并分别给予p38mapk特异性抑制剂sb203580、jnk抑制剂sp600125或erk抑制剂pd98059,观察ucp2对mapk信号通路和下游炎症因子的影响,并明确哪一条mapk信号通路参与了ucp2调控的肺部炎症损伤。观察京尼平对mapk信号通路的影响,进一步证实京尼平通过哪条信号通路保护lps诱导的急性肺损伤。此外,观察ucp2和京尼平对nf-κb信号通路的影响,并通过检测atp水平和5’-amp激活性蛋白激酶(5’-amp-activatedproteinkinase,ampk)信号通路的激活情况明确其调控机制。3.结果:(1)成功构建了过表达ucp2的腺病毒载体ucp2-ad和对照空载病毒ucp2-nc。通过免疫组化和westernblot证实腺病毒体内转染可以显著增加肺组织ucp2的表达(p<0.05),主要表达于肺泡细胞。ucp2-ad感染滴度为5x108pfu/鼠,最佳感染时间为3d,并且通过病理学检测证实腺病毒体内转染不会引起肺组织炎症反应。(2)ucp2表达于正常小鼠肺组织,lps处理后ucp2的表达显著增加(p<0.05);UCP2过表达可显著加重LPS引起的肺组织病理改变、增加炎症细胞浸润、肺组织出血,增加肺组织湿干重比(P<0.05),促进肺水肿;增加炎症因子TNF-、IL-1β的表达(P<0.05);降低急性肺损伤小鼠的存活率(P<0.05)。此外,UCP2加重肺泡细胞线粒体功能不全,减少ATP生成,增加促凋亡蛋白Bax的表达,促进细胞色素C释放,增加激活型caspase 3的表达,TUNEL阳性细胞显著增加,促进细胞凋亡(P<0.05)。相反,京尼平抑制UCP2的表达可以显著减轻急性肺损伤后肺组织的炎症损伤和细胞凋亡。(3)UCP2促进了肺损伤后MAPK通路p38 MAPK、JNK、ERK的激活,促进TNF-α、IL-1β的释放。P38、JNK抑制剂能显著抑制UCP2诱导的细胞凋亡和炎症因子释放,但ERK抑制剂没有作用,结果提示UCP2可能是通过p38 MAPK、JNK通路,而不是通过ERK通路促进肺组织炎症损伤和细胞凋亡。此外,UCP2通过抑制ATP水平激活AMPK通路,进而激活了NF-κB。UCP2抑制剂京尼平可以显著抑制p38MAPK、JNK、NF-κB通路的激活、细胞凋亡和炎症因子的释放。4.结论:(1)上调UCP2的表达加重急性肺损伤炎症损伤,下调UCP2的表达对急性肺损伤起保护作用;(2)UCP2加重ALI肺组织线粒体功能障碍,促进肺泡上皮细胞凋亡;(3)JNK、p38 MAPK、NF-κB信号通路可能参与了UCP2对急性肺损伤的调控作用。