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研究目的:1、探讨胶质瘤细胞中是MKK7还是MKK4调控JNK-c-Jun活性;2、探讨HDAC在胶质瘤细胞中是否调控MKK7或MKK4的表达;3、探讨是哪个或者哪些HDAC成员调控MKK7或MKK4的表达;4、探讨HDAC调控MKK7或MKK4的具体机制是什么;5、探讨干预HDAC或JNK-c-Jun活性是否影响胶质瘤迁移、侵袭;6、探讨人脑胶质瘤组织中HDAC与MKK7或MKK4表达是否存在相关性。研究方法:1.在胶质瘤细胞中使用小分子干扰沉默MKK7或MKK4,Western blot检测p-JNK/JNK,以及p-c-Jun/c-Jun的表达。2.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylases inhibitor HDACI):TSA、SAHA、M344、VPA处理多种胶质瘤细胞后检测MKK7,p-JNK/JNK,以及p-c-Jun/c-Jun的表达。RT-PCR检测MKK7 mRNA表达。3.用小分子干扰HDAC、特异性HDACI、过表达HDAC等方法处理胶质瘤细胞,检测MKK7及p-JNK/JNK,p-c-Jun/c-Jun的表达及MKK7mRNA的表达。报道基因技术检测MKK7荧光素表达。4.(a)免疫细胞化学、细胞浆与核分离实验检测HDAC在细胞核与细胞浆的分布情况;(b)染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)检测HDAC是否在MKK7启动子上;(c)利用报道基因技术检测截短或突变MKK7启动子后对其活性的影响并寻找调控MKK7表达的转录因子;(d)小分子干扰、过表达该转录因子,检测对MKK7表达的影响,抑制HDAC情况下沉默该转录因子,检测MKK7蛋白及mRNA表达。(e)用抑制蛋白合成的抑制剂亚胺环己酮(cycloheximide,CHX)及抑制蛋白降解的抑制剂MG132(Proteasome抑制剂)等处理,检测其对MKK7蛋白的影响。5、小分子干扰、过表达MKK7、HDAC以及特异性HDACI处理胶质瘤细胞,Transwell实验检测这些处理对胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响。6、免疫组化检测HDAC及MKK7在人脑胶质瘤样本中的表达及其相关性。研究结果:1.在胶质瘤细胞中是MKK7而不是MKK4调控JNK-c-Jun活性在胶质瘤U251、U87细胞中沉默MKK7或MKK4,Western blot显示沉默MKK7后JNK-c-Jun活性下调。而沉默MKK4后JNK-c-Jun活性无明显变化。2.抑制HDAC抑制MKK7的表达从而抑制JNK-c-Jun活性分别用HDACI:TSA、SAHA、M344、VPA处理U251、U87、T98G三种胶质瘤细胞,均抑制MKK7,p-JNK,以及p-c-Jun表达均下调,但JNK、c-Jun的表达未发生改变。PCR显示MKK7 mRNA表达下调。3.HDAC4转录调控MKK7在胶质瘤U251中沉默HDAC,Western blot显示在沉默HDAC4或HDAC6时MKK7均下调,RT-PCR显示沉默HDAC4后MKK7mRNA下调,进一步使用HDAC4特异性HDACI:LMK235、Tasquinimod处理U251、U87、T98G后,Western blot显示MKK7及p-JNK,p-c-Jun下调,JNK,c-Jun无明显变化,RT-PCR显示MKK7mRNA下调,过表达HDAC4,MKK7及p-JNK,p-c-Jun上调,JNK,c-Jun无明显变化。RT-PCR提示MKK7mRNA上调。4、转录因子SP1介导了在HDAC4灭活情况下MKK7的负调控(a)将MKK7启动子全长逐步截短,当截短到-149bp时MKK7的荧光素表达明显升高(P<0.05),差异有统计学意义,而截短至-258bp时荧光素表达并没有改变,突变这一段中SP1结合位点,MKK7荧光素表达亦明显升高(P<0.05),差异有统计学意义。(b)干预HDAC4的情况下检测MKK7荧光素表达,结果与MKK7蛋白、mRNA改变是一致的。(c)免疫荧光、细胞浆与细胞核分离实验证明HDAC4在胶质瘤细胞核中有表达,(d)CHIP实验证明HDAC4在MKK7的启动子上。(e)在U251、U87细胞中沉默SP1,Western blot显示MKK7上调,而过表达SP1,MKK7下调。在使用HDAC4抑制剂LMK235抑制HDAC4情况下沉默SP1,MKK7蛋白和mRNA均上调。5、HDAC6介导了MKK7的稳定性在U251、U87细胞中沉默HDAC6,Western blot显示MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表达下调,JNK、c-Jun表达没有变化。但MKK7 mRNA却无明显变化。HDAC6特异性抑制剂Tubacin、CAY10603、ACY1215处理U251、U87、T98G细胞,MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表达下调,JNK、c-Jun表达没有变化。而RT-PCR显示MKK7 mRNA无明显变化。过表达HDAC6后MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表达上调,但MKK7mRNA表达亦无明显改变。CHX时间点处理U251、U87细胞,MKK7在2h就减少了一半,随着时间延长MKK7减少的越来越多。抑制HDAC6情况下MG132处理U251细胞,MKK7的减少受到抑制。6、沉默MKK7抑制胶质细胞迁移、侵袭,抑制HDAC4/HDAC6,抑制胶质细胞迁移、侵袭转染siMKK7、siHDAC4、siHDAC6,用HDAC4抑制剂LMK235、Tasquinimod,HDAC6特异性抑制剂Tubacin、CAY10603处理U251细胞,Transwell实验显示胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力明显下降,而过表达MKK7、HDAC4、HDAC6,胶质瘤细胞迁移侵袭能力明显增强。7、人脑高级别胶质瘤样本中HDAC4/HDAC6与MKK7表达呈正相关收集20例高级别胶质瘤样本,免疫组化检测HDAC4/HDAC6与MKK7的表达,Pearson相关分析HDAC4与MKK7,HDAC6与MKK7的相关性。人脑高级别胶质瘤样本中HDAC4/HDAC6与MKK7表达呈正相关。结论1、在胶质瘤细胞中是MKK7而不是MKK4调控JNK-c-Jun活性;2、HDAC4在胶质瘤细胞中转录调控MKK7的表达;3、转录因子SP1介导了抑制HDAC4情况下MKK7的负调控;4、HDAC6介导了MKK7的稳定性;5、沉默MKK7抑制胶质细胞迁移、侵袭;抑制HDAC4/HDAC6,抑制胶质细胞迁移、侵袭;6、高级别人脑胶质瘤组织中HDAC4/HDAC6与MKK7表达呈正相关性。