日本囊对虾Marsupenaeus japonicus作为重要的对虾养殖品种之一,每年可为水产业带来巨额的经济利润。但对虾的养殖过程中容易遭受一些病原微生物的侵害,包括白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)等。不同于脊椎动物可以经由先天性免疫和适应性免疫协同抵御病原微生物,而无脊椎动物只能通过先天性免疫抵御病原入侵。本文研究了白斑综合征病毒和鳗弧菌感染对虾时的细胞和分子机制,为当前的对虾生产中的病害防治提供了新思路和新方法。1.多聚免疫球蛋白受体样分子是白斑综合征病毒侵染对虾的一种新受体多聚免疫球蛋白受体(The polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是多聚免疫球蛋白(Polxymeric immunoglobulin,pIg)的特异性受体,是免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily,IgSF)的一员。pIgR是I型跨膜糖蛋白,在上皮细胞的基底膜表面表达,可与多聚免疫球蛋白IgA或IgM结合,在上皮细胞中发挥转运功能。研究还发现pIgR可被病原微生物挟持进行自身的转运,从而感染宿主。在本研究中,我们首次在日本囊对虾M japonicus中克隆得到一种多聚免疫球蛋白受体样分子(Polymeric iimiunoglobulin receptor-like protein)的cDNA,命名为AMjpIgR。MjpIgR在血细胞和其他多种组织中均有分布,并在WSSV入侵时,其mRNA水平和蛋白质水平发生明显上调表达。敲低MjpIgR基因的表达和抗体封闭能显著抑制病毒对宿主的入侵,对虾的成活率也显著提高;同时,过表达MjpIgR能促进了病毒的感染。为了确定MjpIgR是否是真正的WSSV的受体,我们首先进行了体外结合实验,发现MjpIgR胞外域可以与病毒的结构蛋白VP24相互作用:又进行了非纳受细胞感染实验,结果发现转染MjpIgR表达质粒并成功表达的MjpIgR的非纳受细胞HEK293T可以感染WSSV病毒。上述这些结果表明MjpIgR被WSSV利用,是该病毒感染对虾的一种新的受体。随着病毒入侵时间的延长,MjpIgR可以发生寡聚化,并随着WSSV的入侵逐步内化。荧光免疫细胞化学实验显示血细胞中的MjpIgR与WSSV病毒粒子可以共定位。流式细胞实验也显示,MjpIgR敲低后发生WSSV内吞的细胞数目显著下降。有报道称钙调蛋白(CaM)可以与网格蛋白相互作用,进一步结合实验发现MjpIgR的胞内域可以与钙调蛋白相互作用。氯丙嗪(CPZ)是一种网格蛋白(Clathrin)依赖的内吞的抑制剂,我们的研究发现这种抑制剂可以使AMjpIgR促进病毒内吞的过程受到明显抑制,因此MjpIgR导致的病毒内吞是网格蛋白依赖的内吞。进一步敲低网格蛋白及其适配蛋白AP-2基因表达的实验都证明可以抑制WSSV的内吞。这些实验说明MjpIgR与CaM结合导致的WSSV的内吞是网格蛋白依赖的。因此,我们的研究表明MjpIgR是WSSV入侵宿主的一种新的受体,WSSV侵染对虾细胞是通过pIgR-CaM-Clathrin途径进行的。这是首次在无脊椎动物中发现多聚免疫球蛋白受体样分子可以作为WSSV入侵对虾的膜蛋白受体。另外根据敲降MjpIgR表达后的对虾成活率实验结果,我们认为MpIgR并不是WSSV入侵宿主的唯一受体。因此WSSV可以利用多种受体侵染宿主细胞。这与病毒可以侵染多种宿主和多种组织的特性是一致的。2.MjKIAA0319L蛋白抑制病毒的复制阅读障碍症相关蛋白KIAA0319是目前被发现的可能引起阅读障碍症的候选蛋白分子。该蛋白是一种含有PKD结构域(也称为Ig结构域)的粘附分子。KIAA0319是一种跨膜蛋白,它含有信号肽、半胱氨酸结合区、PKD结构域和跨膜区。研究发现KIAA0319可以与适配蛋白AP-2结合,介导网格蛋白依赖的内吞途径。在本研究中,我们在对虾体内鉴定到了一种KIAA0319L蛋白(The dyslexia-associated protein KIAA03 19L,MjKIAA0319L),发现它可以响应WSSV的刺激,为了进一步研究MjKIAA0319L蛋白在对虾中的功能,我们进行了 RNA干扰实验,发现RNA干扰后,病毒的复制量上升并切对虾存活率降低,冈此MjKIAA0319L蛋白在对虾中可以抑制WSSV病毒的复制。jKIAA0319L存在WSSV入侵时发生内吞,并且胞内域可以与适配蛋白AP2μ相互作用。但MjKIAA03 19L抑制病毒复制的机制仍需要后续的研究。3.STAT激活抑制蛋白(PIAS)负调控对虾JAK/STAT信号通路的机理研究STAT激活抑制蛋白(Protein Inhibitor of Activated STAT,PIAS)是一类信号转导因子和转录激活激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)的抑制蛋白,参与遗传因子转录调控。PIAS蛋白在酪氨酸激酶(Janus Kinase,JAK)/STAT信号通路中的抑制机制在哺乳类动物和果蝇中有广泛的研究,但是其在甲壳类动物中的调控机制并不清楚。我们在日本囊对虾中鉴定到一种PIAS蛋白,并且发现PIAS蛋白可以被弧菌诱导表达。为了进一步探究我们发现的这种PIAS蛋白在弧菌感染日本囊对虾时发挥的功能,我们做了 RNA干扰实验。当PIAS在对虾中的表达被敲低后再感染鳗弧菌,此时对虾的弧菌清除能力增强并且存活率上升。同时,抗菌肽(ALF-C1,ALF-C2,ALF-Al和Crul-1)的表达水平上升。进一步的研究发现,PIAS敲低后,增强了 STAT的磷酸化和核易位。相互作用实验表明,PIAS蛋白和激活的STAT蛋白相互作用。我们的研究发现PIAS通过抑制STAT的磷酸化和入核负调控JAK/STAT信号通路,从而导致对虾中抗菌肽的表达下降。我们的结果揭示了 PIAS在JAK/STAT信号转导中的一种新的基因调控机制。