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蚜虫是重要的农业害虫,通过吸食植物汁液或传播病毒病可给作物生产造成严重危害。小麦现有种质资源中不仅缺乏有效的抗蚜基因,而且抗性机制不明确,导致抗虫育种进展缓慢。目前,麦蚜防治以喷洒农药为主,但大量使用农药,不仅对人畜有害,而且造成了严重环境污染。通过转基因工程创制小麦抗蚜新种质,是目前急需解决的重要议题。当前应用于小麦抗蚜基因工程的主要有雪花莲凝集素基因(gna)和半夏凝集素基因(pta)等植物凝集素基因,尽管这些基因抗蚜有一定效果,但研究表明gna转基因植物会影响蚜虫天敌的育性,这些基因应用的安全性引起争议。因此,挖掘和利用安全有效的新型抗蚜基因已成为小麦抗蚜基因工程的研究热点。[反]-β-法尼烯【(E)-β-farnesene,EβF】作为大多数蚜虫报警信息素的主要甚至唯一成份,可以使蚜虫产生骚动、从植株上脱落,并吸引蚜虫天敌,从而有效控制蚜虫危害。本研究以欧洲薄荷(Mentha x piperita)、亚洲薄荷(Mentha haplocalyx Briq)、黄花蒿(Artemisia annua)和花旗松(Pseudotsuga menziesii)为实验材料,克隆了其中的EβF合成酶基因并进行了功能分析,而且将MhβFS1基因转入小麦。具体实验结果如下:1.薄荷EβF合成酶基因的克隆及功能分析:(1)利用RT-PCR方法从亚洲薄荷与欧洲薄荷中分离EβF合成酶基因,其中亚洲薄荷有两个不同的cDNA克隆,分别命名为MhβFS1和MhβFS2,MhβFS2与MhβFS1相比,只有一个编码氨基酸残基的差异(第361位V→A),欧洲薄荷中分离的克隆与MhβFS1完全一致;MhβFS1和MhβFS2的基因组序列长度分别为2690 bp和2753 bp,均有6个内含子,且内含子的相位相同(分别为0、1、2、2、0、0)。(2)qRT-PCR实验结果表明MhβFS基因在薄荷根、茎、叶中均有表达,叶片中表达量稍高。(3)获得MhβFS1/MhβFS2融合蛋白,大小为63 kD左右,纯化后制备抗体,抗体效价大于125000。(4)MhβFS1转基因烟草研究:获得转基因植株12株,Southern杂交、qRT-PCR及Western杂交证明了对MhβFS1基因在烟草中的整合和表达。GC-MS结果显示,转基因株系Mh1-1、Mh1-2、Mh1-4和Mh1-6的EβF释放量分别为243、398、644、769 ng/day;驱蚜试验结果显示,转基因烟草植株对蚜虫有一定的驱避作用,与对照相比,Mh1-1、Mh1-2、Mh1-4和Mh1-6转基因株系上的蚜虫数量分别减少7.0%,9. 3%,16.3%和14.0%。2.黄花蒿EβF合成酶基因的克隆及功能分析:(1)从黄花蒿中分离出两个不同的AaβFS cDNA序列,分别命名为AaβFS1和AaβFS2;AaβFS1和AaβFS2有4个编码氨基酸的差异,包括第21位亮氨酸的缺失,50位天冬氨酸取代天冬酰胺,89位亮氨酸取代异亮氨酸,509位甘氨酸取代精氨酸,已将AaβFS1和AaβFS2 cDNA序列提交GenBank,登录号分别为GU294840、GU294841;AaβFS1基因组序列长度为2392 bp,含有6个内含子,相位依次是0,1,2,2,0和0。(2)分别获得AaβFS1和AaβFS2转基因烟草11株和5株。对转基因烟草植株进行了Southern杂交、qRT-PCR和SDS-PAGE等分子检测,确认了AaβFS基因在烟草中的整合与表达。GC-MS结果显示,AaβFS1和AaβFS2转基因烟草植株均能生成EβF,EβF释放量为217~706 ng/day。驱蚜试验显示,转基因烟草植株对蚜虫有驱避作用,与对照相比,Aa1-4-5转基因株系上的蚜虫数量减少了10.0%;蚜虫天敌吸引试验显示转基因烟草植株对大草蛉有吸引作用;在蚜虫与天敌混合试验中,在转基因株系中,Aa1-3-4上蚜虫数量减少16.4%,Aa1-4-5减少23.6%,Aa2-1-2减少10.9%,Aa2-3-6则减少20.0%,说明转基因烟草植株可以通过吸引蚜虫天敌来控制蚜虫虫害。3.花旗松EβF合成酶基因的克隆及功能分析:(1)从花旗松中分离出两个不同的PmβFS cDNA序列,分别命名为PmβFS1和PmβFS2;PmβFS1和PmβFS2 ORF均有2478个核苷酸组成,编码825个氨基酸,PmβFS1和PmβFS2有9个编码氨基酸的差异,相似性为98.9%;PmβFS2基因组序列长度为3846 bp,包含11个内含子。(2)融合蛋白PmβFS1/PmβFS2的大小为94 kD左右,以包涵体的形式存在于沉淀中。(3)经过PCR、qRT-PCR检测,分别获得15株PmβFS1阳性植株和5株PmβFS2阳性植株;GC-MS分析结果显示转基因烟草产生的EβF量过低,可能与PmβFS1和PmβFS2在烟草中的活性不高有关。4. MhβFS1转基因小麦创制:为提高目的基因的表达水平,本研究采用水稻rbcS启动子,并在MhβFS1 5’端引入了水稻rbcS基因的叶绿体转导肽(CTP)、?和kozak序列,3’端引入poly(A)序列,成功构建了适用于小麦基因枪转化的植物表达载体MhβFS1-pG4AB及MhβFS1+CTP-pG4AB;在此基础上进一步构建了适用于小麦农杆菌介导法转化的植物表达载体MhβFS1-pGПUB和MhβFS1+CTP-pGПUB。分别通过基因枪法和农杆菌介导法将其转入扬麦12和科农199,对转基因植株连续进行PCR鉴定和繁殖,已获得T3代转基因种子;选择部分T0株系进行Southern杂交,结果显示MhβFS1基因已整合至小麦基因组,目前正在检测转基因小麦能否释放EβF及其对蚜虫的驱避性。