应激（stress)是在内外环境变化的刺激下，机体出现的非特异性全身反应，包括精神、神经、内分泌和免疫等方面。应激在生命活动中无处不在，适度应激有利于机体度过短期恶劣环境，保存生命，但应激强度过大或持续时间过长则给机体带来损伤。应激可引起人的认知功能损伤。如人在应激后能出现注意力、学习能力、记忆的巩固提取能力、气味识别能力等损伤的现象，这使人们在生活、工作和学习中表现变差，不仅降低个人生活质量，而且给社会和个人带来巨大的经济损失。但目前应激致认知损害的机制并不明确，临床尚无有效防治药物，也无用于早期预警的生物标志物，给临床诊断及有效防治措施研究带来巨大困难。本课题的主要目的是研究应激致认知损害的相关分子、生物标志物以及寻找应激致认知损害的防治药物。　　第一部分急性多重应激致认知损害的相关分子研究　　应激可导致许多动物的学习记忆能力下降以及脑组织树突结构损伤，这些认知损害动物模型为我们寻找应激致认知损害相关的分子及相关通路提供了可能。在本课题中我们采用急性多重应激小鼠模型，首先检测了不同程度应激后受试动物血浆皮质酮浓度、认知行为能力和脑组织树突以及突触结构的变化。进而，我们采用PCR芯片检测了受试动物脑中90个可能与应激和认知功能有关分子的mRNA表达变化，并将差异表达的分子与应激所引起的树突结构的变化进行相关性分析，找出与树突结构变化密切相关的分子。然后采用网络生物学的研究手段，以这些分子为种子构建蛋白-蛋白相互作用网络，分析这些分子的相互作用关系，并对网络中所涉及的分子用功能富集分析的方法寻找它们所涉及的通路和生理途径，为进一步揭示应激致认知损害的分子机制以及干预的靶点和措施研究提供线索。另一方面，我们还同时检测了不同应激程度下外周血有核细胞中上述90个可能与应激和认知功能有关分子的mRNA表达变化情况，旨在寻找能反应应激程度的生物标志物，从而为寻找应激致认知损害的生物标志物提供线索。　　1.不同程度急性多重应激模型的制备及其对学习记忆能力的影响　　为模拟现实中突发的急性复杂的应激因素，采用BALB/c小鼠，同时给予束缚、强光、振荡、噪音和禁水、禁食等刺激，共5hr，制备急性多重应激动物模型。其中，根据光强（67、200或600Lux）、振荡速度(77、130或220rpm)及噪音强度（83、100或120dB）参数的不同将应激分为轻、中和重度三个应激程度，检测三种条件下模型动物血浆皮质酮水平及学习记忆能力的变化。结果如下：　　1.1不同程度急性多重应激条件下血浆皮质酮水平的变化　　为检测不同程度急性多重应激条件下受试小鼠血浆皮质酮水平的变化，在应激开始后30、60、90和120min以及应激结束后4、8和16min，我们对受试动物采血，取血浆，并用 ELISA的方法检测了它们血浆皮质酮的含量。结果显示，无论是在应激开始过程中还是结束后均检测到三个应激组的血浆皮质酮浓度均明显高于对照组，但三者之间无明显区别。结果提示，应激可引起血浆皮质酮浓度升高，但其浓度变化幅度与应激程度的大小无明显关系。　　1.2不同程度急性多重应激对学习记忆的影响　　1.2.1被动回避反应能力　　给予BALB/c小鼠三种程度的急性多重应激后，经90min的情绪恢复，采用跳台实验方法检测动物被动回避反应能力。结果发现，应激后成功小鼠的百分率和潜伏期出现程度依赖性地下降，如对照组、轻度应激组、中度应激组和重度应激组的成功小鼠的百分率分别为75.00％、62.50%、37.50%和14.29%，潜伏期分别为145.63、120.76、96.24和63.91s，其中重度应激组的潜伏期与对照组相比明显下降（P＜0.05）。而应激后的错误次数出现程度依赖性地升高，如对照组、轻度应激组、中度应激组和重度应激组的错误次数分别为0.250、0.500、0.880和0.857，其中重度应激组的错误次数与对照组相比差异明显（P＜0.05）。这些结果显示，急性多重应激可导致跳台实验中成功小鼠百分率显著减小，潜伏期显著缩短，错误次数显著增多，且随应激程度的加重，上述指标的变化逐渐加剧，说明急性多重应激可以程度依赖性地导致小鼠被动回避反应能力明显降低。　　1.2.2物体识别记忆能力　　BALB/c小鼠首先进行新异物体识别相关环境适应，共进行2d，每天2hr，并在第3天接受三种程度的急性多重应激。应激结束后经90min的情绪恢复，采用新异物体识别实验方法检测物体识别记忆能力。结果显示，在应激后的学习期，对照组和各应激组对A和B两个相同物体的探索时间无差异。在学习期后2hr的测试阶段，以新物体C替换旧物体B，以观察动物对新旧物体识别能力的差别，结果发现，对照组及轻度应激组动物探索新物体C的时间明显长于探索旧物体 A的时间，即对新、旧两物体探索时间有明显差别，说明动物仍具有对新异物体感兴趣的特性；而中度应激组和重度应激组动物对新、旧两物体的探索时间无明显差别，说明应激明显损害了动物对新异物体感兴趣的特性。上述结果提示中度或重度急性多重应激损伤了受试动物的物体识别记忆能力。　　2.不同程度急性多重应激对脑内树突和突触结构的影响　　为观察急性多重应激对BALB/c小鼠学习记忆相关脑区树突和突触结构的影响，在给予受试小鼠轻、中和重度应激后30 min，取一半脑用于高尔基染色观察脑组织树突结构和透射电子显微镜观察脑组织突触超微结构（另一半脑用于分子检测），并对整个半脑脑区及海马和皮层高尔基染色显示的树突长度、分支数目和树突棘密度等进行定量分析。结果显示，急性多重应激对整个半脑脑区、海马和皮层的神经元数目均无明显影响，但却显著损伤了海马和皮层的树突和突触结构。　　2.1不同程度急性多重应激损伤了树突结构　　大脑皮层以及其各功能分区包括视皮层、听觉皮层和嗅皮层的树突长度、分支数目和树突棘密度测量结果显示：与对照组相比，重度应激组的整个大脑皮层的树突棘密度明显降低，中度和重度应激组视皮层树突长度明显缩短，而轻度应激组听觉皮层树突分支数目明显增加。不同应激程度组比较的结果显示，重度应激组听觉皮层树突棘密度减少程度显著高于轻度和中度应激组。　　海马以及其各分区包括齿状回、CA1、CA2和 CA3的树突长度、分支数目和树突棘密度测定的结果显示，与对照组相比，各种程度的应激均降低了海马和海马 CA1区的树突棘密度；轻度应激降低了海马CA1的树突长度；重度应激使海马CA3区的树突分支数目减少。　　上述结果显示，急性多重应激对海马和皮层的树突结构均有一定程度的损伤，且随着应激程度的增加损伤加重。　　2.2不同程度急性多重应激损伤了突触结构　　采用透射电子显微镜观察了不同程度的急性多重应激对大脑皮层及海马突触结构的影响，结果发现，急性多重应激降低了突触囊泡的数目、增加了突触间隙、降低了突触的曲率并减少了突触后膜致密质的厚度。其中重度应激组与对照组相比对突触囊泡的数目以及突触的曲率降低最明显，这些结果显示，急性多重应激程度依赖性地损伤了海马的突触结构。　　3.急性多重应激致树突结构变化相关的分子　　3.1急性多重应激所致差异表达分子　　为探索急性应激对受试小鼠海马、皮层和外周血中与应激和认知有关的基因表达情况，采用 PCR芯片的方法检测了有文献报道的90个可能与应激和认知功能有关分子mRNA的表达情况，结果发现：　　在皮层中，应激组APBB1、CLSTN1、KCNA4、NOTCH3、PLAU、RPS6KA1、SYP和TGFB1的mRNA表达与对照组相比明显下调，而KCNA1明显上调；而在海马中，应激组KCNA4、NOTCH3、NTRK3和SNCA的mRNA表达明显下调。　　在外周血中，应激组BACE1的表达明显下调，FOS的表达明显上调，二者均与应激程度密切相关，随着应激程度的增加，BACE1下调程度逐渐增加，而FOS上调程度逐渐增加。该结果提示，BACE1和FOS表达变化的程度与应激程度密切相关，有可能与认知功能损伤程度密切相关，有作为应激程度指示剂或认知损伤标志物进行深入研究的必要。　　3.2差异表达变化分子与树突结构以及各部位间差异表达变化分子的相关性分析　　为探索差异表达分子与树突结构变化之间的相关性以及各部位（海马、皮层和外周血）间差异表达分子间的相关性，我们用Pearson相关性分析的方法来分析海马和皮层中树突结构（树突长度、树突分支数目和树突棘的密度）改变与差异表达分子之间的相关性，以及它们在海马、皮层和外周血中表达变化的相关性。结果发现，在皮层中，应激所引起的基因CLSTN1、PLAU和NOTCH3的表达变化与听觉皮层树突分支的数目变化呈负相关；而TGFB1的表达变化与视觉皮层中树突棘的数目变化呈正比。在海马中， NOTCH3的表达变化与其CA3区树突的分支数目变化呈正比。这些结果提示，CLSTN1、PLAU、NOTCH3和TGFB1可能是应激致认知损害相关的重要分子。另外发现，皮层和外周血中BACE1基因表达变化具有正相关关系，提示外周血中BACE1的变化情况可以提示其在脑中的变化，有作为认知损伤标志物进行深入研究的必要。　　3.3急性多重应激所致树突结构损伤相关分子网络　　为了找出应激致树突结构损伤的分子网络，我们用与树突结构变化具有相关性的四个差异表达变化基因CLSTN1、PLAU、NOTCH3和TGFB1作为种子构建应激致树突结构损伤的相关分子的PPI网络。结果显示，我们得到了一个具有59个节点、136个边，网络直径为6的急性应激致树突结构损伤的PPI网络。其中，TGFB1、PLAU、NOTCH3和CLSTN1度数（degree）分别为28、12、9和6，处于网络的核心位置。综合实验和网络分析的结果提示，TGFB1、PLAU、NOTCH3和CLSTN1可能是急性多重应激致树突结构损伤的关键分子。　　进而，我们采用DAVID平台上的GO功能注释和KEGG通路富集的方法分别对PPI网络中的分子进行功能分析，GO功能注释结果显示，跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号传导通路（transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway）、转化生长因子β受体信号转导通路（TGF-beta receptor signaling pathway）、 Notch信号传导通路（notch signaling pathway）排列在前三位。KEGG通路富集的方法所得到的前三位通路分别为：Notch信号传导通路（notch signaling pathway）、补体和凝血级联（complement and coagulation cascades）、转化生长因子β受体信号转导通路（TGF-beta signaling pathway）。两个方法的结果提示Notch和转化生长因子β受体信号转导通路与急性多重应激引起树突结构损伤关系最为密切，进而提示急性多重应激引起树突结构损伤且最终导致认知损害的最可能的通路是Notch和TGF-beta信号通路。　　第二部分 LW-AFC对急性多重应激致认知损害的防治作用研究　　应激致认知损害是一个复杂的过程，目前国内外研究认为，应激致认知损害可能涉及到 NIM网络失衡、神经递质紊乱、神经生长障碍以及氧化应激等多个生物过程的异常。而我们前期的研究结果发现，应激致树突结构损伤进而引起认知损害的原因是通过扰动了一个由多个与树突结构相关的分子组成的分子相互作用网络引起的。故本研究认为，能够防治应激致认知损害的药物需有调节多个生物过程的功能。我国传统的中药大多有这样的特点。目前国内外已研究发现许多对应激所导致的认知损害具有明显的预防和治疗作用的药物几乎均为中药或其提取物，如狭叶柴胡（Bupleurum falcatum, BF）的提取液、甘草提取液、四逆散和ω-3脂肪酸等。这些中药主要是通过调节胆碱能神经系统、促进神经生长以及神经保护作用从而缓解应激所造成的神经系统功能损伤。　　六味地黄汤（ Liuwei Dihuang Decoction, LW）是中医滋补肾阴的经典名方，我室多年研究结果表明调节NIM网络是其主要作用机制。LW-AFC是由LW活性成分群组成的新复方，本实验室前期研究发现，LW及LW-AFC对多种慢性应激所致的NIM网络紊乱具有明显改善作用，对快速老化模型小鼠SAMP8和转基因小鼠APP/PS1表现出的认知功能障碍具有明显改善作用。本研究的目的在于考察LW-AFC能否改善急性多重应激所造成的认知功能损伤以及其可能的作用途径或机制。　　在本研究我们采用对应激敏感的BALB/c小鼠作为受试对象，实验分为6组，分别为对照组、应激组、阳性药组、LW-AFC低、中、高三个剂量组。在急性多重应激前2周每天灌胃给予低、中、高三个剂量的LW-AFC至应激前30min。而只在应激当天的应激前30min灌胃给予阳性药美替拉酮（可针对性地降低应激引起的皮质酮升高）。给药完成后应激组、阳性药组、LW-AFC低、中、高三个剂量组给予同时束缚、强光（600Lux）、振荡（220rpm）、噪音（120dB）和禁水、禁食等刺激，共5hr。检测各组受试小鼠被动回避反应能力以及皮层中90个与应激和认知功能相关的分子的表达变化。结果如下：　　1. LW-AFC对急性多重应激致被动回避反应能力的损伤具有改善作用　　采用跳台实验检测了受试小鼠的的被动回避反应能力，结果发现，应激组的成功小鼠百分率明显低于对照组，而阳性药和LW-AFC给药后对应激造成的成功小鼠百分率下降现象均有改善作用，其中LW-AFC中剂量和高剂量效果最好。（对照组、应激组、阳性药组、LW-AFC低、中、高剂量组的成功小鼠的百分率分别为60.00%、14.29%、42.86%、28.57%、62.50%和62.50%）。应激组的潜伏期与对照组相比明显下降，而给予阳性药和LW-AFC后对应激造成的潜伏期下降现象均有改善作用，其中阳性药和LW-AFC中剂量和高剂量效果较为明显。（对照组、应激组、阳性药组、LW-AFC低、中、高剂量组的潜伏期分别为148.69、46.48、138.93、85.19、148.11和136.62s）。另外，应激组的错误次数明显高于对照组，而阳性药、LW-AFC中剂量和高剂量对应激所造成的错误次数升高现象均有改善作用，其中LW-AFC中剂量和高剂量效果最好。（对照组、应激组、阳性药组、LW-AFC低、中、高剂量组的错误次数分别为0.330、1.140、0.570、1.290、0.290和0.430）。结果显示，应激降低了成功小鼠百分率，缩短了潜伏期并增加了错误次数，提示应激导致小鼠的被动回避反应能力损伤， LW-AFC剂量依赖性地增加了成功小鼠百分率，延长了潜伏期并减少了错误次数，其中，中剂量和高剂量LW-AFC给药组可使它们恢复到正常状态，提示LW-AFC预防给药对急性多重应激所造成被动回避反应能力障碍具有良好的保护作用。　　2. LW-AFC对急性多重应激致认知损害作用分子机制的初步探讨　　2.1 LW-AFC对急性多重应激引起的分子表达变化的调节作用　　跳台实验结束后，小鼠断头取脑，并分离出皮层，进而我们用 PCR芯片的方法检测了皮层中90个与应激和认知功能相关的分子。结果发现，应激使皮层中 NEFH、NEFM、NSF、PLAU、PRKCA、STAT3、STUB1、APBB1、NTRK3、GRIA2和NOTCH3的表达下调。而给予LW-AFC后，NEFH、PLAU、STAT3和STUB1有明显的上调的趋势。　　2.2 LW-AFC所调节的皮层中能够改善急性多重应激致认知损害的分子网络特征　　应激致认知损害是通过扰动具有多个生理功能的网络而引起的，LW-AFC是通过调节怎样的分子网路而改善应激致认知功能的损伤。我们首先得到了在皮层中LW-AFC可调节的4个应激引起差异表达的分子，即NEFH、PLAU、STAT3和STUB1，以它们作为种子来构建 PPI网络，结果我们得到了一个具有9个节点、10个边，网络直径为4的特异的PPI网络。其中网络中的9个分子为MAPK1、STAT3、AR、STUB1、NEFH、PLAT、PLAU、MET和HGF。提示，LW-AFC可能通过调节由MAPK1、STAT3、AR、STUB1、NEFH、PLAT、PLAU、MET和HGF多个分子组成的相互作用网络，进而改善急性多重应激所引起的被动回避反应能力损害。　　随后我们结合 DAVID平台上的GO功能注释和 KEGG通路富集的方法分别对LW-AFC所调节的PPI网络中的分子进行功能分析，GO功能注释结果显示酶联受体蛋白信号通路（enzyme linked receptor protein signaling pathway）排在首位。而KEGG通路富集的方法发现癌症途径（Pathways in cancer）排在首位。结果提示，LW-AFC所调节的相互作用分子可能参与酶联受体蛋白信号通路和癌症途径，即LW-AFC可能通过调节酶联受体蛋白信号通路或癌症途径（Pathways in cancer）的过程从而改善急性多重应激对被动回避反应能力的损伤。　　通过以上研究，可以得到以下初步结论　　1.不同程度的急性多重应激程度依赖性地引起受试小鼠被动回避反应能力、物体识别记忆能力以及海马和皮层中树突和突触结构损伤。不同程度的急性多重应激所引起受试小鼠血浆皮质酮浓度升高与应激程度无关，但应激结束后血浆皮质酮的恢复具有应激程度依赖性，应激程度越强，皮质酮越难以恢复到正常状态。　　2.急性多重应激引起树突结构损伤进而导致被动回避反应能力和物体识别记忆能力损伤所涉及的关键分子为 PLAU、NOTCH3和TGFB1，而关键的信号通路为Notch和TGF-beta信号通路。　　3.外周血中BACE1和FOS的表达可以反映应激程度的改变，有望成为应激致认知损害的生物标志物。　　4. LW-AFC对急性多重应激所致认知损伤具有保护作用，而调节PLAU、NEFH、STAT3和 STUB1所组成的分子相互作用网络以及所涉及的酶联受体蛋白信号通路和癌症途径两条通路可能是其发挥作用的途径。