目的:慢性荨麻疹(CU)是一种多因素引起的皮肤黏膜疾病,其主要特征是反复发作的水肿性风团,自觉瘙痒,病程6周以上,严重时常伴有咽喉黏膜血管性水肿,危及生命。由于本病病因复杂,病程长短不一,反复发作,难以预防,治疗上常规抗组胺药物效果并不理想的特点,因此对CU的发病机制及其防治的研究已成为医学界的重要课题。现代医学研究发现:T辅助细胞亚群(Th1与Th2)功能失衡与慢性荨麻疹的发病密切相关。慢性荨麻疹患者外周血单一核细胞(PBMC)分泌的Th1细胞因子水平下降,而Th2细胞因子水平升高,经治疗后Th1/Th2细细胞因子趋向平衡,因此慢性荨麻疹是一种以Th2细胞优势占主导的皮肤免疫炎症反应。祖国医学历来保留有治疗慢性荨麻疹的有效方剂,但是多年来对它们的研究仅陷于临床上的观察,缺乏更深入的实验研究。本实验选用祖国医学治疗慢性荨麻疹的经典方剂当归饮子、玉屏风散,研究它们对慢性荨麻疹患者外周血单一核细胞(PBMC)分泌的Th1/Th2细胞因子的影响,并对其作用机制进行初步的探讨,为经典方剂当归饮子、玉屏风散治疗慢性荨麻疹提供科学的理论依据。 方法: 1.临床慢性特发性荨麻疹患者的选用标准: 1.1 皮肤黏膜表面复发性风团,持续时间不超过24小时。 1.2 每周发作不少于2次。 1.3 病程超过6周。 1.4 1周内未使用抗组胺药物,1月内未使用类固醇激素药物及免疫抑制药物。 1.5 排除由寒冷、压力、振动、日光、运动、情绪、摩擦等引起的物理性荨麻疹。 1.6 排除自身免疫性疾病。如甲状腺疾病,白癜风,胰岛素依赖型糖尿病,类风湿关节炎等。 2.外周血单一核细胞的分离技术:慢性荨麻疹患者31名,体外抽取患者新鲜静脉血10ml,采用Ficoll等密度沉降分离法,得到淋巴细胞与单核细胞,以RPMI1640培养液定容,制成细胞悬液,细胞终浓度为1×10~6/ml。 3.细胞活力的检测方法:选用台盼蓝排斥试验,以0.4%的台盼蓝染色,在3min内计数活细胞达95%以上。 4.培养细胞的常规观察: 4.1 形态和细微结构变化:淋巴母细胞体积变大,细胞核明显,有团块凝集现象。 4.2 培养液的观察:正常新鲜的含酚红的培养液为桃红色,一旦很快变黄,注意是否有细菌污染的可能。 5.原代细胞的培养:以RPMI1640培养液及96孔细胞培养板体外培养,37℃置CO2培养箱中孵育48小时,以2000r/min离心20min,,收集上清液-20℃冻存待测。 6.体外药物敏感性预试验:采用MTT比色试验法,当归饮子、玉屏风散单湖北中医学院硕士研究生毕业论文独或联合P队体外用药,作用于慢性尊麻疹的PBMC,以0D值检测其细胞毒作用。 7.实验分组:分成空白对照组和实验用药组,各组均设3复孔,空白组是100ul细胞悬液加100ull64o培养液,实验组为IO0ul细胞悬液加入不同浓度10一,~10一79/m1中药IOOul培养,加入的植物血凝素PHA终浓度为20ug/m1 8.检测方法:用ELISA方法检测各组上清液的细胞因子(IL一4、工NF一Y)的含量。 结果: 1形态和细微结构变化:T细胞在体外受到植物血凝素(PHA)或中药+PHA刺激后,发生一系列增生反应,如细胞体积变大,细胞核明显,胞浆增多,出现空泡,染色质疏松,有团块凝集现象,证明淋巴细胞转化为淋巴母细胞。单独中药体外刺激未见上述现象。 2中药的细胞毒实验:当归饮子、玉屏风散单独体外用药作用于慢性尊麻疹PBMC,有使细胞增殖作用,且增殖作用最明显在10一49/m1浓度。 3 PHA最佳浓度的探测:以MTT比色试验法探测本次试验PHA最佳刺激浓度为20ug/m1· 4慢性尊麻疹患者外周血PBMC体外中药单独刺激作用:两种中药方剂,单独体外作用于患者外周血单一核细胞,实验组和空白对照组相比,IFN一丫的含量略升高,无显著性差异(P)0.05);实验组工L一4的含量略升高,无显著性差异 (P>0.05);IFN一Y/IL一4的比值略升高,无显著性差异(P>0.05)。 5慢性尊麻疹患者外周血PBMC体外中药联合PHA协同刺激作用:和空白对照组相比,实验用药组在加入不同浓度的中药后,工FN一Y的含量较空白组明显升高,并有显著性差异(P<0.05)。工L一4的含量较空白组略升高,无显著性差异 (卿0.05)。工FN一Y/工L一4的比值升高,并有显著性差异(P(0 .05).而七种剂量用药组之间有显著性差异(P<0.05)。 结论:当归饮子、玉屏风散联合PHA体外作用,均有促使慢性尊麻疹患者外周血单一核细胞由Tho细胞优先向Thl细胞转化的趋势,改变患者ThZ体液免疫的主导地位,逆转尊麻疹患者Thl/ThZ型细胞因子不平衡的状态,从而达到治疗作用,其体外作用与适当剂量有关。主题词:慢性尊麻疹外周血单一核细胞 Thl细胞因子ThZ细胞因子 白细胞介素4干扰素丫型 当归饮子玉屏风散