研究背景随着近年来耐药、耐多药结核的不断蔓延,结核这个古老的疾病正日益成为当今社会公共卫生安全的巨大威胁。继1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”后,2009年WHO再次发布报告:耐药、耐多药结核正在全球蔓延,中国在世界22个耐药结核高负担国家中位列第二,仅次于印度[1]。脊柱结核是最常见的肺外结核,随着耐药肺结核疫情的恶化,耐药脊柱结核的发病率势必逐渐升高。通过耐药检测详细了解结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis, MTB)的耐药情况,并以此为依据指导抗结核化疗方案的制定,对于脊柱结核的临床治疗具有重要的意义。传统的耐药检测手段是基于罗氏培养的药敏试验,其检测耗时长(2～3个月[10])、阳性检出率低(30.86%[7]),无法充分满足临床应用的需要;随着相关政策法规日益规范化,为防止活性菌株在检测操作过程中可能发生的污染、泄漏等问题,所有涉及MTB活菌的检测均须依托于P3实验室,高昂的硬件建设费用使结核药敏试验在一般综合医院的推广普及相当困难。BACT/ALERT 3D是诞生于上世纪90年代的细菌自动培养分析系统,用于结核耐药检测虽可缩短耗时,但仅能进行5种一线药物的药敏试验。我科在前期研究中对上述两种方法整合改进,将绝对浓度法药敏试验“嫁接”在BACT/ALERT 3D系统培养之后,在保证了药敏试验全面性的同时将检测耗时缩短至平均42天[10];然而在耐药结核高发的今天,42天的检测周期依旧可能使患者面临术前、术后无效化疗的危险。基因芯片技术(DNA Chip)是一种集快捷、灵敏、简便等众多优势于一身的检测手段,随着结核耐药相关基因的逐步分析确定,已有国内外学者初步研究证实,该技术用于MTB分离株的异烟肼、利福平耐药检测均有令人满意的效率和准确性。此外,基因芯片耐药检测的对象是MTB的DNA,检测本身无需接触活菌、生物安全性高,便于推广应用。总之,基因芯片结核耐药检测具有良好的临床应用前景。目的前期工作已针对MTB的BACT/ALERT 3D系统培养与传统罗氏培养开展了大量的对比研究,初步建立了以“BACT/ALERT 3D系统培养”联合“绝对浓度法药敏试验”的改进型方法[10]。本研究以上述改进型方法为标准,将基因芯片的检测结果与之对比,初步评价基因芯片技术临床应用于脊柱结核耐药检测的可行性,并为下一步设计针对更多种抗结核药物的耐药检测芯片提供理论依据。材料与方法选择我科2009年3月至2010年3月收治的51例临床诊断的脊柱结核患者,收集病灶脓液及干酪样坏死组织进行检测。1. BACT/ALERT 3D系统培养及绝对浓度法药敏试验:临床标本经常规前处理后,接种至专用液体培养基,置于BACT/ALERT 3D系统内进行培养;报告为阳性者进行传统菌种鉴定,同时进行绝对浓度法药敏试验(包含异烟肼、利福平在内的11种抗结核药物)。2.基因芯片菌种鉴定及耐药检测:临床标本经常规前处理后,经核酸提取、PCR扩增后,进行基因芯片菌种鉴定;鉴定为结核分枝杆菌者进行基因芯片耐药检测(异烟肼和利福平两种药物)。汇总结果,以BACT/ALERT 3D系统培养及绝对浓度法药敏试验的结果为标准,将基因芯片检测的结果与之对比,从检测耗时、阳性检出率、耐药符合率等方面初步评价基因芯片用于脊柱结核耐药检测的临床可行性。结果1. BACT/ALERT 3D系统培养及绝对浓度法药敏试验1.1 BACT/ALERT 3D系统培养结果共培养标本51例,培养阳性27例,阴性24例。阳性检出率为52.9%。1.2菌种鉴定结果对培养为阳性的标本27例标本,以对PNB(对硝基苯甲酸)、TCH(噻吩-2-羧酸肼)和L-J(改良罗氏培养基)进行菌种鉴定。鉴定结果:27例均鉴定为MTB,其中人型26例,牛型1例。1.3绝对浓度法药敏试验结果51例中共27例进行药敏试验,发现7例存在耐药,耐药率25.9% (7/27)。1.4检测耗时51例中共27例培养为阳性并完成药敏试验,单例耗时介于28～58d,平均42d。2.基因芯片菌种鉴定及耐药检测2.1基因芯片分枝杆菌菌种鉴定结果51例标本均参加基因芯片菌种鉴定,其中42例鉴定为MTB (结核分枝杆菌复合群,包括人型、牛型),阳性检出率82.4%。在3D系统培养报告阳性并鉴定为MTB的27例标本中,基因芯片菌种鉴定的结果与之全数符合;3D系统培养报告阴性而未能进行菌种鉴定的24例标本中,15例由基因芯片菌种鉴定为MTB,另外9例为阴性结果。2.2基因芯片结核分枝杆菌耐药检测结果对菌种鉴定为MTB的42例标本进行基因芯片耐药检测,发现耐药相关基因存在突变而判断为耐药的标本共9例,其余的33例标本未检测到基因突变而判断为对异烟肼及利福平均敏感。以绝对浓度法药敏试验结果为标准,异烟肼耐药检测敏感度为100%、特异度为100%,利福平耐药检测的敏感度为100%、特异度为91.7%。基因芯片耐药检测的整体符合率为92.6%。9例耐药标本中有4例发现于3D系统培养阴性而无法进行传统药敏试验的标本中。2.3检测耗时共42例标本经基因芯片菌种鉴定为结核分枝杆菌并完成耐药检测,单例耗时介于18~ 23 h,平均20 h。结论1.基于结核分枝杆菌培养的药敏试验阳性检出率低、耗时长、生物安全性较差、对实验条件的要求过高,不利于临床应用的推广普及。2.基因芯片技术用于脊柱结核耐药检测的检测耗时短,阳性检出率高,耐药检测的敏感度、特异度、整体符合率均令人满意,且开展检测的生物安全性好,便于推广普及,临床应用的可行性较好。3.目前基因芯片结核耐药检测的药物种类有限,进一步研发针对更多种药物的结核耐药检测芯片势在必行。