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温度依赖型性别决定（temperature-dependent sex determination,TSD）是一种典型的表型可塑性现象,主要存在于一些爬行动物中,例如红耳龟（Trachemys scripta）、密西西比鳄鱼（Alligator mississippiensis）、豹纹守宫（Eublepharis macularius）等。这类爬行动物没有性染色体、根据孵化温度范围来决定个体性别,其中,红耳龟能在较小的孵化温度范围（26℃～32℃）内产出不同性别比率的后代。不同于研究较深入的基因型性别决定（genetic sex determination,GSD）（主要存在于哺乳动物和鸟类）,TSD的机制研究较为肤浅,许多谜团未被破解。本文对红耳龟性别决定机理展开研究,15期之前红耳龟性腺并未形成,随着性腺发育至热敏期（15-19期,也称性别决定时期）时,呈现出温度依赖性差异表达模式（如Dmrt1、Sox9、AMH等基因）。Foxl2作为一个遍布脊椎动物各门间高度保守的雌性基因,许多研究仅检测了Foxl2的表达模式,并未进行功能研究。本研究通过对红耳龟早期胚胎性腺进行转录组测序分析,筛选获得了性别决定和分化相关基因,并对Foxl2基因进行了克隆和表达分析。同时,通过基因功能缺失和获得分析,重点研究了Foxl2基因在红耳龟雌性性别决定和分化中的作用。以下为具体的研究结果:（1）红耳龟胚胎性腺转录组分析本研究选用红耳龟早期胚胎性腺组织,进行转录组测序,共构建了12个c DNA文库（F16和M16、F17和M17各3个）,经比对分析后,筛选条件设为padj<0.05,相对于FPT性腺,在第16和17期两性性腺中分别获得了差异表达基因474个和810个。其中,第16期FPT（female-producing temperature）性腺中上调的基因有193个,MPT（male-producing temperature）性腺中下调的基因有283个;17期中,显著上调基因数有412个,显著下调的有298个。根据GO富集和KEGG通路富集,分析差异基因的功能,并结合富集情况及其它脊椎动物中的相关报道,筛选到4个性别决定和性别分化相关基因（Foxl2、Dmrt1、Kdm6B、AMH）,其中Foxl2在第16和17期FPT性腺中的FPKM值明显大于MPT性腺。（2）Foxl2的c DNA序列克隆和表达分析采用RACE克隆技术,获得长度为2324 bp的Foxl2基因c DNA序列,其中,1～258 bp为5’非编码区（UTR）,1164～2324 bp为3’非编码区（UTR）为,259～1164bp为开放阅读框（ORF）为（共906 bp）,一共编码的氨基酸有301个。RT-PCR结果显示,Foxl2在成年卵巢组织中高度表达,肝脏、脾脏中也存在少量表达,但在睾丸、肾脏、肌肉中未见表达。q RT-PCR结果进一步证明Foxl2在成年卵巢中的表达量显著高于睾丸,而在一些组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉）中仅检测到微弱或未检测到Foxl2的表达信号。q RT-PCR分析结果显示Foxl2在处于热敏期第16和17期开始呈现FPT性腺特异性高表达,MPT性腺中始终维持低的表达水平,呈现典型的依赖温度的表达模式。此外,温度置换实验结果显示,MPT置换至FPT后的第3天,Foxl2表达量出现快速上调;经雌激素E2诱导处理后的第16和17期MPT胚胎性腺中,Foxl2基因表达量也发生明显地升高,表明Foxl2能够快速响应温度和性激素的变化。（3）Foxl2功能缺失和获得研究通过构建慢病毒Foxl2敲低和过表达载体系统并在性别分化前分别引入红耳龟FPT和MPT胚胎,实现了该基因的高效敲低和异位表达效应。组织形态学观察和分子水平研究结果表明,敲低Foxl2后的FPT性腺外形和组织结构明显雄性化,睾丸分化关键基因Dmrt1和Sox9表达明显上调,同时在雄性化的性腺髓质区检测到了大量的雄性蛋白AMH和SOX9的荧光信号,生殖细胞由皮质区迁移至髓质区,与雄性分布特征类似,此时FPT性腺发生了雌转雄性逆转现象。相反地,Foxl2过表达后的MPT性腺则向雌性方向分化,皮质区高度发育,髓质区退化,Dmrt1和Sox9表达显著下调,雌性分化关键基因Rspo1表达上升,AMH和SOX9蛋白表达几乎消失,生殖细胞完全分布在发达的皮质区,呈现雌性所具有的分布特征。以上研究结果充分表明Foxl2基因在红耳龟早期雌性性腺形成过程中是必需的关键调控因子,且能够充分启动雌性分化过程,位于TSD雌性信号通路上游位置。本研究首次鉴定了一个爬行动物雌性性别决定的雌性关键调控基因,为TSD分子机制的进一步解析奠定基础。