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生物分子的甲基化是表观遗传学的重要内容之一,其甲基化的状态会影响机体的生长、发育以及疾病的发生、发展。而α-酮戊二酸（α-KG,α-ketoglutaric acid）和Fe2+依赖的双加氧酶能够使生物分子氧化脱甲基,是维持正常甲基化的途径之一。但是,双加氧酶的过度活跃或过度表达,可能会导致局部的低甲基化,因此,双加氧酶抑制剂引起研究者的注意。目的:1.本课题旨在研究两种双加氧酶（组氨酸脱甲基酶JMJD3和核酸脱甲基酶TET1）对氨基酸、碱基等生物分子的选择性羟基化作用（甚至氧化）,并分析其可能位点;2.研究中黄酮类化合物（20余种）以及维生素C对以上两种酶催化氧化作用的影响,分析其可能的化学机制。方法:本研究选取JMJD3酶和TET1酶,作为双加氧酶的代表,以7种碱基（5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、5-乙基尿嘧啶、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶、1,3-二甲基尿嘧啶、9-甲基鸟嘌呤、茶碱）和二十种人体所需的氨基酸为底物（包括:酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸）。在α-KG/Fe2+条件下,通过超高效液相色谱和电喷雾四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）技术检测氧化产物。根据氧化产物的质谱图（数据用于质谱解析）,同时利用ChemBioDraw 16.0软件建立化学分子模型,分析其氧化产物的氧化位点。基于上述实验,选择苯丙氨酸和5-乙基尿嘧啶为底物,加入黄酮化合物（底物:黄酮=100:1、50:1和10:1）干预JMJD3酶和TET1酶的催化氧化反应,通过UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS检测酪氨酸和5-乙基尿嘧啶氧化产物的峰面积大小,分析黄酮类化合物对JMJD3酶和TET1酶催化氧化的调控作用以及可能存在的构效关系。结果:1.在UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS谱图中,我们发现在JMJD3酶介导5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、5-乙基尿嘧啶和1,3-二甲基尿嘧啶反应液中均检测到对应的氧化产物峰（C5H5N3O2、C5H4N2O3、C6H6N2O3和C6H6N2O3）;而在茶碱、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶和9-甲基鸟嘌呤的反应液中均检测到了对应的羟基化产物峰（C7H8N4O3、C6H9N3O和C6H7N5O2）,甚至在2-氨基-4,6-二甲基嘧啶反应液中检测到两个甲基均被羟基取代的产物峰。在JMJD3酶介导的以氨基酸为底物的反应液中,仅仅在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸四种氨基酸反应液中检测到了对应的羟基化产物峰。同时,发现TET1酶还能够介导甲硫氨酸羟基化。2.黄酮化合物分别以三种不同摩尔比浓度（底物:黄酮=100:1、50:1和10:1）参与JMJD3酶和TET1酶介导的苯丙氨酸羟基化反应时,产物峰面积随着黄酮浓度的增大而逐渐减小。但是,异鼠李素、二氢杨梅素、异槲皮苷以及杨梅苷等在低浓度（底物:黄酮=100:1）时,其羟基化产物（酪氨酸）的峰面积分别为678、322、531和380,与阴性对照组相比有所增加（阴性对照组的酪氨酸的峰面积为215）。3.维生素C介导JMJD3酶和TET1酶催化苯丙氨酸羟基化的峰面积分别为1970和1751（底物:维生素C=10:1）,其峰面积约是阴性对照组的10倍。但是,在以5-乙基尿嘧啶为底物时,其氧化产物的峰面积均约为阴性对照组的2倍。同时,黄芩素、白杨素、连苯三酚和野黄芩素,这四种物质也能够促进JMJD3酶和TET1酶催化氧化5-乙基尿嘧啶,因摩尔比的不同,其促进作用存在差异,同时与阴性对照组相比,不存在抑制作用。结论:第一,在α-KG和Fe2+条件下,双加氧酶JMJD3和TET1均能够催化氧化多种类型的底物,并能够选择性地作用于甲基基团,生成相应的氧化产物,同时根据甲基连接的原子或化学位置的不同,表现出不同的氧化程度。当甲基连接在C原子上时（如CH3-C）,一般底物被氧化为酰基产物,而连接在N原子上时（如CH3-N）,催化产物为羟基化物质。第二,当底物为氨基酸时,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸这三种芳香族氨基酸以及脂肪族缬氨酸能够被氧化为相应的羟基化物质。其中苯丙氨酸被氧化为酪氨酸,即是苯环上的H原子被-OH取代,这可能为苯丙氨酸转化为酪氨酸提供新的途径。第三,维生素C能够促进双加氧酶JMJD3和TET1催化氧化多种类型的底物,可能与它自身的促氧化作用有关,而不仅仅是与TET1酶特异性结合,增强酶的活性。第四,大多数黄酮化合物能够抑制JMJD3酶和TET1酶对苯丙氨酸的羟基化作用,在实验浓度下,存在剂量依赖;但某些黄酮（如二氢杨梅素、杨梅苷、异鼠李素等）能够双向调节双加氧酶对底物的羟基化作用:低浓度时,促进催化氧化反应;高浓度时,抑制其催化氧化反应。这种双向调节作用可能与黄酮化合物络合Fe2+的能力以及黄酮骨架上多羟基的促氧化作用有关,尤其是连苯三酚式片段。总的来说,黄酮化合物调控双加氧酶催化氧化作用可能是通过清除已生成的自由基;络合Fe2+,减少溶液中Fe2+的含量;还原铁酰离子FeⅥ=O,降低其价态,使之失去催化活性;或占领酶分子的空穴,以阻止FeⅥ=O的镶嵌,抑制其催化活性。但是,有些黄酮或黄酮在特定的浓度下,又表现出促氧化作用,这可能是部分黄酮能加强酶促的氧化或羟基化的原因之一。