1.高效灵敏水稻生长素标记系统的建立及应用 2.人类UGT1基因家族遗传多样性分析

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生长素作为植物体内重要的激素之一,在多种形态学建成过程中发挥着必不可少的关键作用,但是由于缺乏合适的分子研究工具对其进行定性和定量分析,因此在水稻体内的分布情况仍然未知,再加上缺少相关的水稻突变体鉴定研究,生长素在水稻发育中的具体生物学功能更是知之甚少。由于之前的DR5-GUS生长素报告系统存在较差的空间表达精确度、极低的表达时间分辨率,以及对实验条件的高要求等缺点,我们采用在水稻物种中具有高表达活性的DR5-VENUS,同时以依赖于SCFTIR1经典生长素信号通路的DII-VENUS元件做为负对照,后者是在水稻生殖器官组织中具有稳定表达活性的玉米Ubiquitin-1启动子的作用下起始转录的,实现了在细胞水平上更加精确地定位水稻生长素响应位点以及表达水平的目的。我们首次成功地将生长素报告系统应用到水稻物种中去,并在细胞水平上系统性地分析了生长素的行为规律,为进一步研究生长素与水稻花发育、侧根发育等多个生物学过程之间的分子机制提供了可靠依据。首先我们通过活体成像技术观察到水稻不同组织和不同花发育时期中生长素的表达位置及动态变化。进一步通过药物、激素以及自然重力等多种处理发现,这两个报告系统不仅能对药物1-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)和1-萘氨甲酰苯甲酸(N-1-Naphthylphthalamic acid,NPA)处理做出快速反应,同样也能对细胞分裂素之一的反式玉米素(Trans-zeatin,TZ)以及重力刺激产生响应,从而诱导生长素响应信号在体内发生重排,水稻根部处理前后的qRT-PCR实验数据从mRNA水平上再次证实了上述结论。水稻中发现有四个pin-formed 1(PIN1)生长素输入蛋白,氨基酸序列比对和进化树分析显示OsPIN1a,OsPIN1b为拟南芥AtPIN1的直系同源基因,OsPIN1c和OsPIN1d则为其旁系同源基因,拓扑结构分析显示他们具有高度类似的跨膜特征。在水稻花发育的不同时期,通过PIN1蛋白单抗免疫染色以及转基因苗ProOsAUX1:OsAUX1-sGFP激光共聚焦显微镜观察发现,生长素转运载体PIN1同源蛋白和auxin resistant 1(OsAUX1)的蛋白定位与DR5-VENUS的表达位点高度重叠,表明生长素是控制水稻花器官形成的关键因子之一。总之,通过本研究我们成功建立了两个水稻生长素报告系统DR5-VENUS和DII-VENUS,并在此基础上验证了两系统的高效性和灵敏性。使用该套工具,我们重现了生长素在水稻多个组织以及根和花器官不同发育时期内的响应位点、含量和动态变化。进一步通过单双子叶植物内生长素分布的比较,发现了生长素在两者茎顶端分生组织、侧根形成以及花序分枝形成中的潜在功能差异。另外,我们分析了水稻生长素相关基因OsAUX1的表达特征,发现该基因主要存在于主根的中央维管组织、分生区表皮以及成熟区表层,osaux1突变体的根系表现出异常的向地性响应、根生长角度改变和根毛变短等表型。运用我们建立的生长素报告系统和GC-MS定量测定结果进一步揭示出低磷条件可诱导生长素在根尖维管束组织和表皮层中的浓度上升,表明OsAUX1蛋白载体参与负责将生长素分子定向运输到根成熟区,通过刺激根毛的生长,最终促进根毛对磷的吸收。此项工作为水稻生长素的深入研究提供了新的分子工具,并且进一步揭示了生长素定位、定量、运输和重要农业性状(比如根系结构、粮食产量等)之间的紧密相关性;同时也首次揭示了OsAUX1基因可以通过直接控制生长素水平的动态变化来实现对根毛伸长的调控,从而使水稻根系对外界磷元素做出适应性响应的新分子机制。人体适应性免疫和防御系统需要机体内大量的生物分子多样性来抵御生存大环境中的多种病毒、细菌和有害化学物质,人体有限基因组的多种调控机制,包括基因复制、基因转座、基因转换、DNA重排、拷贝数变异等,为上述功能的实现提供了强大的遗传基础。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶家族1(UDP-glucuronosyltransferase family 1,UGT1)基因家族的编码产物属于二类药物代谢酶类,通过将尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)中的葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GA)基团转移给受体分子,从而把一系列內源或外源的有毒物质(例如环境毒物或治疗性药物)葡萄糖醛酸化,最终将其转变成高亲水性分子排出人体外。除了已知的可变剪切和启动子可选择性两种遗传机制赋予了UGT1产物的多样性外,单核苷酸多态性也被报道会影响该酶的代谢活性,并且某些特定位点的突变与临床疾病存在统计学上的相关性,如高胆红素血症,吉尔伯特症以及癌症治疗药物的副作用等。随着UGT1基因簇中一些致病单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的分子检测在国际上其他民族人群中不断投入临床应用,清楚地了解中国人群基因大背景下UGT1单核甘酸多态性的存在状态及分子特征变得非常必要。本文首次阐述了UGT1基因簇的SNP种类,群体频率以及连锁情况,并筛选出了相关生物标记物,为临床UGT1分子诊断应用提供了理论基础。本研究对253个外周血样品基因组DNA开展大量重测序工作,系统地分析了中国汉族人群中UGT1基因簇,其中涵盖9个第一外显子、5个恒定外显子、内含子以及启动子序列,全长约17.7 kb,中的SNP位点及其分布特征,并在此基础上计算了连锁不平衡水平进而构建了具有种族特异性的连锁图谱。釆用贝叶斯统计方法推断出了在汉族人群中可能存在单倍型类型,进一步运用STAMPA程序筛选出了对应的标签位点(tag SNPs),为临床UGT1药物基因组研究中的SNP分型奠定理论基础。最后通过与三个haplotype map(Hap Map)民族(日本人JPT,白种人CEU,非洲人YRI)间的比较,找出了UGT1基因SNP位点所特异的分子多样性遗传特征。此项研究为中国人群的UGT1药物基因组学研究和关联分析打下了理论基础,并且为UGT1基因簇相关疾病的个体化风险评估以及个体化医疗提供了临床指导意义。
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