大鼠DnaJ样蛋白rDJL的功能研究

来源 :中国协和医科大学 中国医学科学院 北京协和医学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hudongfei
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  精子发生是一个高度复杂而有序的过程,在此过程中基因的表达具有严格的时间性和空间性,正是这种受到严格时空调控的基因表达,使得睾丸干细胞经过有丝分裂、减数分裂最终分化、发育为成熟的精子。分离、克隆不同发育阶段的差异表达基因,深入研究它们在精子发生中的作用,对于阐明精子发生机理和对人类的生殖健康、避孕疫苗的研制以及男性不育的防治均有重要意义。   为深入研究rDJL基因的功能,我们对rDJL蛋白的编码区C端进行PCR扩增,并克隆到原核细胞表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌获得了高效表达。利用大板胶切胶的方法纯化GST-rDJL融合蛋白,以此为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了高效价的抗rDJL蛋白多克隆抗体。用此抗体进行Westernblot分析,在大鼠睾丸组织抽提液得到特异性较高的目的条带,与rDJL预计分子量相符,能够用来进行rDJL蛋白的组织和亚细胞定位研究及进一步的功能研究。   用自行制备的抗rDJL抗体进行rDJL蛋自在睾丸组织的免疫组织化学定位研究。结果显示:rDJL从精母细胞时期开始表达,直到圆形精子细胞、长形精子细胞和成熟精子,而在精原细胞、Sertoli细胞和睾丸间质组织则无rDJL表达。该结果与Northernblot发育表达谱的结果一致。制备生精细胞涂片做细胞免疫荧光的结果进一步明确了rDJL在生精细胞中的亚细胞定位:在精母细胞中散在分布于胞浆中;在圆形和长形精子细胞中呈偏一侧的核旁定位;在成熟精子中定位于顶体区和精子尾部。构建真核载体转染模式细胞后,发现外源表达的rDJL融合蛋白在细胞中呈囊泡状结构。以上结果提示rDJL功能可能与精子发生过程中囊泡转运和顶体形成有关。   
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