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L-正缬氨酸是一种非蛋白质氨基酸,最早发现是枯草芽孢杆菌产生的天然抗菌肽的组成成分。目前,L-正缬氨酸的主要应用是作为关键的医药中间体,用于合成治疗各种高血压与充血性心力衰竭的药物培哚普利。L-正缬氨酸主要是依靠化学合成,直接合成手性纯的L-正缬氨酸会涉及到剧毒原料氰化物且收率低,不利于环境保护。生物催化剂由于严格的立体选择性同时反应条件温和且催化效率高,在手性化合物的合成上一直备受关注。因此,本论文构建一种多酶级联催化体系,用于制备手性纯的L-正缬氨酸。混合型底物DL-正缬氨酸经体系中的酶特异性氧化和不对称还原将其中D-正缬氨酸转化成对映异构体L-正缬氨酸从而获得手性纯的产物。首先初步构建多酶级联表达工程菌株,然后对其中关键酶进行分子改造同时利用数学模型模拟最佳多酶级联体系,并以此为依据进一步调控酶表达的水平,最终实现只需通过发酵单株工程菌即可制备用于高效转化合成手性L-正缬氨酸的最佳多酶级联体系,不需要在转化前人工额外地调配体系中酶的比例。主要内容如下:（1）构建了重组菌E.coli BL21/L-nor1用于共表达合成L-正缬氨酸的多酶级联体系,该体系含有D-氨基酸氧化酶（DAAO）、过氧化氢酶（CAT）、甲酸脱氢酶（FDH）和L-亮氨酸脱氢酶（LDH）,主要转化过程:外消旋混合物DL-正缬氨酸中的D-正缬氨酸经DAAO特异性氧化生成2-氧代戊酸,然后被LDH不对称胺化还原成对映异构体L-正缬氨酸,其中CAT用于消除反应副产物H2O2,以防止中间产物2-氧代戊酸脱羧,FDH与LDH组合用于辅酶NADH循环再生。重组菌表达后制备的粗酶液或者全细胞可作为级联催化剂直接用于转化合成手性纯L-正缬氨酸。对两种体系的转化条件进行了优化,其中粗酶液体系最佳转化温度为30°C和最佳转化pH为7.5,全细胞体系的最佳转化温度为35°C和最佳转化pH为8。对比两种转化体系,粗酶液体系完全转化40 mM底物的时间比全细胞体系快1 h。同时发现转化过程中产生的蛋白质氧化剂过氧化氢影响甲酸脱氢酶的操作稳定性,导致转化后期辅因子NADH供应不足,中间产物积累,底物完全转化时间延长。（2）利用理性设计二硫键,通过二硫键的配对消除游离半胱氨酸,提高了甲酸脱氢酶对蛋白质氧化剂的耐受性。通过定点突变构建获得突变体酶A10C、I239C和组合突变体酶A10C/I239C,并验证了突变体酶中二硫键的形成。突变体酶的酶学性质研究发现,突变体酶A10C和A10C/I239C在热稳定性和蛋白质氧化剂的耐受性方面提高较为明显,60°C下的t1/2值分别提高了6.7和7.8倍,对强蛋白质氧化剂铜离子的耐受浓度由5 mM提高到了15 mM以上。特别是A10C在催化效率和比酶活方面相比野生型分别提高了1.3和1.4倍。因此,A10C被替换到多酶级联体系中。分批转化验证表明,突变体酶A10C有效解除了转化中后期因蛋白质氧化剂氧化失活导致中间产物积累的问题,缩短了多酶级联体系转化的时间。（3）为了进一步提高多酶级联体系的转化效率、缩短转化时间。利用DAAO N-端氨基酸序列的一系列改造提高其在大肠杆菌中的可溶性表达,进而提高体系中DAAO的酶活,缩短底物中D-正缬氨酸氨酸完全氧化的时间。首先对DAAO N-端第二个氨基酸的研究发现,N-端的组氨酸对DAAO的可溶性表达有重要的作用,同时额外添加甘氨酸能进一步提高DAAO的活性表达,但是重组菌的宿主细胞量相比野生型有所下降。因此,利用N-端的组氨酸残基个数来调节表达的DAAO酶活和对应重组菌生长的生物量,发现当N-端组氨酸个数为三的时候（即突变体酶3-HG）,重组菌的最终体积酶活达到最高,同时细胞生物量也没有明显的降低。最后,将优化后的N-端氨基酸序列MHHHG替换到野生型DAAO的N-端无规卷曲（序列MHSQK）中。相应的重组菌进行5 L发酵罐放大发酵,最终体积酶活为80.7 U/mL,体积产率可以达到4.48 kU/（L·h）,相比野生型提高了3.4倍。将突变体酶替换到多酶级联体系中,底物完全氧化的时间由原来的5 h缩短到2 h左右,但由于中间产物的积累,底物完全转化的时间为3 h左右。因此,需要确定体系中酶的最佳含量或配比,然后再进一步优化。（4）通过分析L-正缬氨酸转化过程中涉及的反应速率方程及相关的底物和产物,全面了解转化过程涉及的各种因素,然后使用多底物米氏方程描述体系中酶的反应速率,并建立了反应过程中物质的质量守恒方程,从而得到描述整个转化体系的数学模型。在最佳转化温度和最佳转化pH条件下,利用初始速率法测定体系中酶的动力学参数,带入模型中模拟,结果与相同条件下的L-正缬氨酸的转化过程的实验数据基本吻合,证明所构建的数学模型能够准确地描述L-正缬氨酸的转化过程。利用模型进一步预测了不同DAAO和FDH酶量体系及不同LDH和FDH酶量体系的转化效率,获得保证转化速率达到最大值的98%以上和底物完全转化率达99.8%以上的体系中酶活的最低要求。结果表明,除FDH的酶活没有达到最低要求值4.67×102 U/L外,其他酶的酶活均大于最低值。（5）通过优化重组质粒上CbfdhA10C基因RBS的强度,将FDH酶活提高了4.7倍,同时其他三个酶的活性相比未优化前都保持在96%以上。相应的重组菌E.coli BL21/L-nor3-r4制备的多酶级联催化剂用于转化验证,底物完全转化的时间缩短为2 h。同时级联体系可进一步稀释放大,并在转化24 h后仍然可以满足最佳转化体系的要求,提高了体系利用率。进一步采用梯度补料策略在5 L发酵罐上进行转化,粗酶液体系最终转化的L-正缬氨酸浓度为498.2 mM（58.4 g/L）,全细胞体系最终转化的L-正缬氨酸的浓度为398.6 mM（46.7 g/L）,且两种体系的转化率和ee值都大于99%。考虑到成本和生产线原因,利用5吨发酵罐发酵制备多酶级联体系,得到的粗酶液稀释后在20吨发酵罐上放大生产,获得产物L-正缬氨酸的浓度为429.6 mM（50.3 g/L）,转化率大于95%,手性纯度ee值大于99%,收率达到90%以上。