研究目的目前,同种器官移植已在临床广泛开展,对治疗器官衰竭、血液疾病以及恶性肿瘤发挥了不可替代的作用。然而发生于移植术后数周或数月的急性排斥反应(AR, Acute rejection)仍是导致治疗失败的主要因素。移植术后常规使用的免疫抑制性药物严重降低了患者机体的免疫功能,导致了感染、肝肾损伤,影响了移植受者的预后。为解决这一难题,研究者们利用多种细胞和生物因子及制剂,通过不同途径诱导机体产生特异性的免疫耐受以克服非特异性的免疫抑制剂的严重毒副作用。目前移植免疫耐受研究的热点之一是扩增调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)或增强其功能。既往研究表明,Treg细胞是参与维持外周耐受的重要细胞,应用Treg细胞诱导免疫耐受具有多种优势,因而有可能被发展为诱导移植免疫耐受和治疗器官移植排斥的重要工具细胞。目前体外扩增的Treg进行细胞治疗方案的应用受到很多因素制约,而应用药物扩增受体机体内的Treg细胞比例或者增强Treg细胞抑制能力的方案具有更好的应用前景。人体内的Treg细胞主要存在于CD4+CD25hi(高表达)细胞亚群中,约占外周血CD4+T细胞的1%～2%。Treg细胞作为在体内外均具有调节免疫反应功能的重要细胞群,可根据其表达的细胞表面分子、产生的细胞因子及作用机制分为天然存在的CD4+CD25+Treg细胞(Naturally occurring CD4+CD25+Treg, nTreg)和诱导性CD4+CD25+Treg细胞(Induced CD4+CD25+Treg, iTreg)。大量动物移植模型的研究证实,两种Treg细胞对于维持移植物良好生存状态都具有重要作用,提高Treg细胞比例可以诱导免疫耐受、减轻排斥反应。在实体器官移植中,与等量nTreg相比,体内和体外同种异体抗原特异性诱导产生的iTreg能更好地延长移植物存活期及诱导免疫耐受。Treg细胞的免疫调节机制主要包括以下几个方面：对抗原递呈细胞(Antigen presenting cell, APC)的抑制作用,介导靶细胞溶解、杀伤靶细胞,分泌TGF-β (Transformation growth factor-β,转化生长因子-p)和IL-10(Interleukin-10,白介素-10)发挥免疫抑制功能等。Treg细胞抑制CD4+效应T细胞的机制主要通过细胞间直接接触、分泌细胞因子、与APC结合后改变其代谢途径或分泌方式等途径。Treg细胞除高表达CD4和CD25之外,还表达一种特征性标志Foxp3(Forkhead transcription factors,叉头样转录因子3),其对Treg细胞的表型、发育和功能性维持具有重要作用。研究发现机体内Treg细胞比例和Foxp3的表达情况可以作为改善受体免疫状态及诱导耐受的重要指标。然而关于如何扩增Treg细胞,上调Foxp3表达以及增强Treg细胞抑制性效应的研究目前仍不够明确,因此仍需寻找能够有效扩增机体Treg细胞比例或增强其抑制能力的安全制剂。研究发现,将人CD4+T细胞与基因重组鞭毛蛋白(rFliC)体外共培养后可显著增强CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制能力并提高Foxp3的表达。并且鞭毛蛋白可以保护机体免受化学、细菌、病毒以及放射性损伤。因此,鞭毛蛋白或可作为一种能够增强Treg细胞功能,诱导机体产生移植免疫耐受的制剂。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要成分,是Toll样受体5(Toll-like receptor5, TLR5)的特异性配体。TLR5在人T细胞以及小鼠Treg细胞上均有表达。Toll样受体(TLR)家族是介导天然免疫的重要因素,可在病原体入侵机体的早期即启动天然免疫,继而激活获得性免疫应答,对免疫病理损伤有重要作用。鞭毛蛋白介导的免疫应答依赖于经典的TLR信号通路,可特异性激活TLR5, TLR5下游信号为MyD88依赖性并且与NF-κB或MAPK活化相关,MAPK通路受到多种因素的调控。综上所述,本论文的科学假设是：rFliC可通过扩增同种移植受体CD4+CD25+Treg细胞比例,提高Foxp3表达,增强其增殖能力及抑制性效应,诱导同种移植免疫耐受。本研究试图阐明rFliC对同种移植物生存状态的影响,并且探讨rFliC此种作用的内在机制、信号途径及调控因素,从而为研究利用rFliC诱导移植免疫耐受提供理论和实验依据,为临床器官移植排斥的治疗提供新的制剂,因此具有重要的理论和实际意义。第一部分rFliC对小鼠同种皮肤移植物的影响及与TLR5表达的相关性研究方法1、提取并纯化基因重组鞭毛蛋白(rFliC)利用携带GST-FliC-Burkholderia pseudomallei基因的pGEX4T-2质粒及BL21E.col感受态菌构建BL21E.coli-GST-FliC菌株；抗生素抗性筛选后,对目标菌株进行活化及诱导表达,然后利用Glutathione Sepharose4B凝胶提取基因重组鞭毛蛋白(rFliC),并使用ToxinEraser endotoxin removal resin去除细菌内毒素(Lipid polysacchride, LPS)污染。2、构建小鼠同种皮肤移植模型无菌条件下将制备的C57BL/6小鼠背部全厚度皮片移植至BALB/c小鼠背部并进行包扎,移植术后第7日拆包。在移植术进行第-1、3、5、7、9、11日向实验组小鼠i.p.注射rFliC (3mg/kg);同时设立等量PBS缓冲液注射组为对照组。3、研究rFliC对同种皮肤移植物生存状态及生存期的影响从拆包之日起,每日观察两组小鼠皮肤移植物的生长状态及排斥情况,记录移植皮片排斥百分比及生存期。在PBS对照组小鼠的移植皮片完全排斥当日,脱颈椎处死两组小鼠,完整取下供体皮片及受体移植床部位组织,进行甲醛固定并制备石蜡切片,应用HE染色观察移植物组织病理情况。4、检测rFliC对同种皮肤移植物与移植受体TLR5表达的影响在PBS对照组小鼠的移植皮片完全排斥当日,取受体移植床部位的移植皮片组织,进行甲醛固定并制备石蜡切片,应用抗-TLR5抗体进行免疫组化染色观察移植物TLR5表达情况。研究结果1、PBS对照组小鼠的皮肤移植物较早出现硬化、结痂、皱缩,拆包后至完全排斥进程较快。与对照组相比,rFliC处理组小鼠的皮肤移植物生长状况良好,排斥情况较轻,排斥进程较缓慢,皮肤移植物生存期明显长于对照组(p<0.05)。结果表示rFliC可以明显延长小鼠同种皮肤移植存活期,改善移植物生存状态。2、移植物病理分析结果显示：对照组小鼠移植皮片皱缩、变薄,表皮及真皮明显坏死,移植物与受体组织间连接疏松,受体组织内存在大量以单个核细胞浸润为主的细胞浸润；而rFliC处理组小鼠的皮肤移植物平展、厚实,表皮及真皮未显示明显坏死,移植物与受体组织间连接紧密,受体组织内的炎性细胞浸润也较轻微。此结果进一步证实rFliC促进同种皮肤移植物生存。3、移植物免疫组化染色结果显示：与对照组相比,rFliC处理组小鼠皮肤移植物的TLR5被激活,呈高表达状态,提示rFliC对同种皮肤移植物生存的影响可能与TLR5激活相关。第二部分rFliC对小鼠同种移植受体Treg细胞的影响研究方法1、构建小鼠同种皮肤移植模型建立小鼠同种皮肤移植模型,随机分为rFliC注射组、对照组及TLR5阻断组。rFliC组：在移植术进行第-1、3、5、7、9、11日向小鼠i.p.注射rFliC (3mg/kg),对照组小鼠i.p.注射PBS缓冲液；TLR5阻断组：在移植术进行第-1日向小鼠注射rFliC前1h,向小鼠i.p.注射TLR5抗体(200μg/只),其它处理同rF1iC组。2、检测移植受体CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群比例PBS对照组小鼠移植皮片完全排斥当日,脱颈椎法处死三组小鼠,制备脾细胞悬液及腋窝淋巴结细胞悬液,然后应用CD4、CD25、Foxp3单克隆抗体进行荧光染色,使用流式细胞仪检测三组小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在CD4+细胞中的比例。3、检测移植受体脾细胞Foxp3表达状况在PBS对照组小鼠移植皮片完全排斥当日,脱颈椎处死三组小鼠,取出脾脏,进行甲醛固定并制备石蜡切片,应用抗-Foxp3抗体进行免疫组化染色检测受体小鼠脾Foxp3表达情况。4、检测移植受体Treg相关分子表达PBS对照组小鼠移植皮片完全排斥当日,脱颈椎处死三组小鼠,取出脾脏,制备脾细胞悬液并应用免疫磁珠分离CD4+CD25+Treg细胞。应用实时定量RT-PCR技术检测TLR5、Foxp3. TGF-β1及IL-10表达水平。应用Western blot技术检测TLR5及Foxp3表达。5、移植受体Treg细胞增殖实验PBS对照组小鼠移植皮片完全排斥当日,脱颈椎处死三组小鼠,取出脾脏,制备脾细胞悬液,并进一步分离CD4+CD25+Treg细胞。将三组Treg细胞分别培养4d后,向培养基内掺入3H-TdR,继续孵育16h后,收集细胞,应用液体闪烁计数器检测各组细胞dpm (Decay per minute)计数。6、移植受体Treg细胞抑制实验PBS对照组小鼠移植皮片完全排斥当日,脱颈椎处死三组小鼠,取出脾脏,制备脾细胞悬液,并进一步分离CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25" Teff细胞(Effector T cell,效应T细胞),同时使用野生型BALB/c小鼠制备Teff扭胞。分别将对照组、rFliC处理组及TLR5阻断组小鼠Treg细胞培养3d,然后将对照组、rFliC处理组及野生型小鼠Teff分别与三组Treg进行混合,继续孵育24h后向培养基内掺入3H-TdR,孵育16h后,收集细胞,应用液体闪烁计数器检测各组细胞dpm计数。7、制备同种抗原制备野生型B6小鼠脾细胞悬液后,加入40μg/ml丝裂霉素C避光孵育40min,PBS洗涤后,用培养液重悬,即为同种(异型)抗原递呈细胞(APC)野生型B6小鼠的脾细胞进行超声破碎后离心收集上清,即为可溶性同种(异型)抗原。8、检测体外同种抗原刺激下Treg细胞相关分子表达制备野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞,加入同种抗原刺激后收集细胞,应用半定量RT-PCR技术检测TLR5、Foxp3、TGF-β1及IL-10表达情况,应用Western blot技术检测TLR5及Foxp3表达情况。TLR5阻断组：将Treg细胞用TLR5阻断抗体进行预处理。9、体外同种抗原刺激Treg细胞增殖实验制备野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞,分别加入APC细胞、APC+rFliC或rFliC进行刺激后,掺入3H-TdR检测细胞增殖水平。TLR5阻断组：将Treg细胞用抗TLR5阻断抗体进行预处理。10、体外同种抗原刺激Treg田胞抑制功能实验制备野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25-Teff田胞,首先对Treg细胞进行APC或APC+rFliC刺激,然后洗涤,再将Treg与Teff共培养,最后检测共培养细胞增殖水平。TLR5阻断组：将Treg细胞应用阻断抗体进行预处理。研究结果1、rFliC处理组小鼠脾淋巴细胞及腋窝淋巴结细胞CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群在CD4+T细胞中的比例均显著高于对照组。TLR5阻断组小鼠脾淋巴细胞及腋窝淋巴结细胞中三阳性Treg细胞比例均明显低于rFliC处理组。结果表明rFliC可以扩增同种移植受体Treg细胞比例,此作用与TLR5途径相关。2、三组小鼠脾免疫组化染色结果显示：与PBS对照组相比,rFliC处理组小鼠Foxp3表达显著增加,而TLR5阻断组Foxp3;表达与rFliC处理组相比受到明显抑制。此结果表明,rFliC可通过TLR5相关性途径激活小鼠同种移植受体Treg细胞,上调Foxp3表达。3、应用qRT-PCR技术检测移植受体Treg细胞TLR5、Foxp3、TGFβ1及IL-10的表达情况。结果显示：rFliC处理组四种分子的mRNA表达与PBS对照组相比均有显著提高；而应用TLR5阻断抗体之后,rFliC对四种分子表达的上调作用受到显著抑制。各组小鼠Treg细胞表达TLR5和Foxp3的情况通过Western blot技术进行了验证。以上结果表明rFliC对同种移植小鼠模型的刺激可增加Treg相关分子的表达,而此种作用与TLR5途径相关,结果进一步证实了rFliC对移植受体Treg细胞的激活作用。4、移植受体Treg细胞增殖实验结果显示：rFliC处理组小鼠Treg细胞增殖水平与PBS对照组相比显著增高,而TLR5阻断组小鼠Treg细胞的增殖水平相比rFliC处理组受到明显抑制。此结果表明rFliC通过TLR5依赖性途径上调移植受体Treg细胞的增殖功能。5、移植受体Treg细胞与Teff细胞共培养结果显示,三组Treg细胞中rFliC-Treg对Teff的抑制能力最强,而此作用在TLR5阻断后受到明显下调。以上结果表明rFliC对移植受体Treg细胞的功能起到激活上调作用,此作用与TLR5途径相关。6、rFliC对体外同种抗原刺激的Treg细胞的分子表达及功能的影响与体内实验结果一致,从体外进一步证实了rFliC对同种抗原刺激的Treg细胞的作用。第三部分rFliC对同种抗原激活的Treg细胞Foxp3表达影响的分子机理与调控研究方法1、检测rFliC对Treg细胞JNK、p38MAPK信号的活化情况应用同种抗原刺激野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞后,加入rFliC进行梯度时间刺激,用Western blot检测各时间点JNK及p38MAPK磷酸化情况。2、检测rFliC活化的Treg细胞JNK、p38MAPK信号与Foxp3表达的相关性应用同种抗原刺激Treg细胞,阻断JNK及p38MAPK信号,加入rFliC刺激后, Western blot检测Foxp3蛋白表达情况。3、检测rFliC对Treg细胞PI3K-Akt信号的活化情况应用同种抗原刺激Treg细胞后,加入rFliC进行梯度时间刺激,用Western blot检测各时间点Akt磷酸化情况。4、检测Treg细胞中rFIiC激活的PI3K信号对p38MAPK活化的影响应用同种抗原刺激Treg细胞,阻断PI3K信号,加入rFliC刺激后,用Western blot检测不同时间点p38MAPK磷酸化情况。5、检测Treg细胞中rFIiC激活的PI3K信号与Foxp3表达的相关性应用同种抗原刺激Treg细胞,阻断PI3K信号,加入rFliC刺激,应用Western blot及RT-PCR检测Foxp3表达情况；应用同种抗原刺激小鼠脾淋巴细胞,阻断PI3K信号,加入rFliC刺激,应用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞在CD4+T细胞中的比例。6、检测Treg细胞中rFliC激活的PI3K及p38MAPK信号与Foxp3表达的相关性应用同种抗原刺激Treg细胞后,先阻断p38信号,再阻断PI3K信号,然后加入rFliC刺激,应用Vestern blot及RT-PCR检测Foxp3表达情况；应用同种抗原刺激小鼠脾淋巴细胞后,先阻断p38信号,再阻断PI3K信号,加入rFliC刺激后应用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞在CD4+T细胞中的比例。研究结果1、rFliC作用于同种抗原激活的Treg细胞,可活化JNK及p38MAPK信号。而p38MAPK信号与rFliC引起的Foxp3表达上调相关,即rFliC对同种抗原激活Treg细胞Foxp3表达的作用通过rFliC-p38-Foxp3通路实现。2. rFliC可以激活同种抗原刺激Treg细胞的PI3K-Akt信号。并且PI3K信号对p38MAPK活化具有负调节作用。3、PI3K对rFliC-p38-Foxp3通路具有负调控作用,而调控方式通过抑制p38MAPK信号活化实现。全文结论1.rF1iC体内应用可以明显改善小鼠同种皮肤移植物生存状态,延长移植物生存期,诱导同种移植免疫耐受。并且rF1iC可激活移植物TLR5表达,提示rF1iC诱导同种移植免疫耐受的作用与TLR5途径相关。2.rFliC可明显提高同种移植受体CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,上调Treg细胞相关分子Foxp3等表达水平,增强Treg细胞功能,并且这些作用都与TLR5途径相关。提示rFliC诱导同种移植免疫耐受的机制可能是通过TLR5相关途径上调Treg细胞功能。3. rFliC刺激Treg细胞后对Foxp3表达的上调可通过rFliC-p38MAPK-Foxp3通路实现,而PI3K可通过抑制p38信号活化对此通路起负调控作用。论文创新点1.首次利用小鼠同种皮肤移植模型,证实rFliC可明显延长小鼠同种皮肤移植物生存时间,诱导同种移植免疫耐受,从而为进一步研发诱导实体器官移植免疫耐受的新型制剂提供了实验依据。2.首次证实rFliC可以提高小鼠同种移植受体CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例及功能,并且作用机制与TLR5途径相关。为研究鞭毛蛋白诱导同种移植免疫耐受的细胞及分子机制提供了实验基础及理论依据。3.首次证实rFliC上调Treg细胞Foxp3表达的作用与p38MAPK活化相关,即可通过rFliC-p38-Foxp3通路实现,证实了PI3K信号对此通路具有负调控作用。从而为研究鞭毛蛋白诱导同种移植免疫耐受的信号传导途径及调控靶点提供了新的思路。