论文部分内容阅读
目的:（1）探讨hsa＿circ RNA＿0002141在口腔鳞癌组织及细胞中表达水平,及其对增殖与侵袭功能的影响（2）探讨hsa＿circ＿0002141对口腔鳞癌细胞的调控作用,验证mi R-217与hsa＿circ＿0002141和HMGA2的靶向结合关系。探讨hsa＿circ＿0002141通过调节mi R-217/HMGA2轴对于口腔鳞癌细胞增殖的影响以及作用机制。（3）hsa＿circ＿0002141对于口腔鳞癌细胞株裸鼠荷瘤的影响。方法:（1）q RT-PCR方法检测癌组织和癌旁正常组织中hsa＿circ RNA＿0002141的表达水平。（2）差异基因慢病毒分别转染至HSC3细胞或SAS细胞,RT-q PCR检测转染效果;通过CCK-8法检测细胞活力,克隆形成实验测定细胞克隆形成数目,Transwell实验计数细胞迁移数目与侵袭数目,流式细胞术测定细胞凋亡率;（3）应用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）检测人口腔癌细胞系与人正常口腔角质形成细胞HNOK中hsa＿circ＿0002141、mi R-217的表达差异。选择表达量高的细胞株细胞进行后续实验。（4）抑制或过表达hsa＿circ＿0002141后,通过CCK-8法、EDU染色、Transwell检测观察hsa＿circ＿0002141对口腔鳞癌细胞株增殖的影响。（5）在SAS口腔癌细胞株中,对mi R-217进行过表达功能实验,观察过表达mi R-217是否可以逆转过表达hsa＿circ＿0002141对口腔癌细胞增殖的作用。（6）应用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）检测人口腔癌细胞系与人正常口腔角质形成细胞HNOK中mi R-217与高迁移率族蛋白A2（high mobility group A2,HMGA2）的表达差异。（7）分析mi R-217对口腔鳞癌细胞中内质网应激介导的自噬与凋亡的影响及其分子机制。在SAS口腔癌细胞株中脂质体法进行转染和内质网应激抑制剂4-苯丁酸处理后,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况,细胞免疫荧光染色检测细胞中微管相关蛋白1轻链3（LC3）表达,蛋白质免疫印迹（Western Blot）测定细胞中自噬相关蛋白LC3I、LC3II及Beclin-1的表达水平,RT-q PCR和Western Blot测定细胞内内质网应激相关分子CCAAT/增强予结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins,CHOP）、葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78,GRP78）及天冬氨酸蛋白水解酶-12（Caspase-12）的表达水平;双荧光素酶报告基因检测实验和Western Blot验证mi R-217对HMGA2的靶向作用。（8）通过脂质体2000将携带有hsa＿circ＿0002141sh RNA或NC-sh RNA序列的载体转染到SAS细胞中。经过筛选获得抑制hsa＿circ＿0002141表达的稳转细胞株。（9）将转染好hsa＿circ＿0002141sh RNA（或NC sh RNA）的SAS细胞注射到裸鼠右侧腋窝皮下,实验分为SAS组、NC sh RNA组、hsa＿circ＿0002141sh RNA 3组。接种后,持续观察三组裸鼠肿瘤生长情况,1周后肿瘤长出,之后每隔2 d测量一次肿瘤体积,21 d后处死两组裸鼠,收集肿瘤并对肿瘤组织称重。（10）q RT-PCR检测各组肿瘤组织中hsa＿circ＿0002141、mi R-217和HMGA2 m RNA的表达水平。（11）免疫组织化学检测各组肿瘤组织中cyclin D1、Ki67、P16蛋白的表达情况。结果:（1）在18种口腔癌细胞异常表达的circ RNA中,hsa＿circ RNA＿0002141表达水平最高;（2）q RT-PCR检测癌组织及癌旁正常组织hsa＿circ RNA＿0002141的表达水平癌旁正常组织和癌组织hsa＿circ RNA＿0002141的表达水平分别为0.018±0.006和0.033±0.006。经统计分析,与癌旁组织相比,癌组织中hsa＿circ RNA＿0002141的表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）转染sh-circ＿0002141慢病毒的HSC3细胞和SAS细胞中,hsa＿circ RNA＿0002141相对表达量显著降低（P＜0.05）;与Control组和sh-circ NC组比较,sh-circ＿0002141组HSC3细胞和SAS细胞的活力均显著下降（P＜0.05）,细胞克隆形成数目、迁移数目及侵袭数目均显著减少（P＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）;（4）与人正常口腔角质形成细胞HNOK比较,hsa＿circ＿0002141在几种人口腔鳞癌细胞系中表达显著上调,而mi R-217在几种人口腔鳞癌细胞系中表达显著下调（P＜0.05）。在SAS细胞中hsa＿circ＿0002141的表达水平最高,mi R-217的表达水平最低,因此选择SAS细胞株进行后续实验。（5）抑制hsa＿circ＿0002141表达SAS细胞增殖活性下降,Ed U阳性率降低,细胞迁移与细胞侵袭数目均减少（P＜0.05）;而过表达hsa＿circ＿0002141细胞增殖活性上升,Ed U阳性率升高,细胞迁移与细胞侵袭数目均增加（P＜0.05）。（6）hsa＿circ＿0002141参与调控口腔鳞癌细胞株的增殖,hsa＿circ＿0002141与mi R-217之间存在互补靶向结合位点,mi R-217靶向负调控hsa＿circ＿0002141表达（P＜0.05）。双荧光素酶实验表明两者存在靶向结合关系。过表达mi R-217可逆转过表达hsa＿circ＿0002141对口腔鳞癌细胞迁移与侵袭的作用,降低细胞增殖活性（P＜0.05）。（7）与人正常口腔角质形成细胞系HNOK比较,人口腔鳞癌细胞系HSC3、SAS、SCC15、Fa Du中mi R-217相对表达量显著下调（P＜0.05）,而HMGA2相对表达量则显著上调（P＜0.05）（8）mi R-217对口腔鳞癌细胞增殖的影响及其对HMGA2的调控作用,在SAS细胞中转染,mi R-217mimics可以升高SAS细胞凋亡率,mi R-217mimic+4-PBA组SAS细胞凋亡率又明显下降,自噬相关蛋白及内质网应激相关分子表达也均明显下调,双荧光素酶实验表明两者存在靶向结合关系。（9）抑制hsa＿circ＿0002141表达后促进裸鼠肿瘤生长与NC sh RNA组相比,抑制hsa＿circ＿0002141表达组的裸鼠肿瘤生长缓慢、肿瘤重量变小。（10）相对于SAS组,sh-circ NC组中circ＿0002141、mi R-217和HMGA2 m RNA表达水平均未明显变化;而在sh-circ＿0002141组中circ＿0002141和HMGA2 m RNA表达水平均显著下调,mi R-217表达水平显著上调。（11）cyclin D1、Ki67、P16蛋白在裸鼠移植瘤中的表达情况,相对于SAS组、sh-circ NC组,sh-circ＿0002141组cyclin D1和Ki67表达水平均显著下调;而sh-circ＿0002141组中P16表达水平显著上调;结论:（1）hsa＿circ＿0002141在癌组织中表达显著高于癌旁正常组织。（2）hsa＿circ＿0002141参与调控口腔鳞癌细胞株的增殖,抑制hsa＿circ＿0002141的表达显著降低细胞的增殖能力;过表达hsa＿circ＿0002141显著增强细胞的增殖能力。（3）mi R-217分别与hsa＿circ＿0002141和HMGA2存在靶向结合关系,mi R-217表达受hsa＿circ＿0002141的负向调控,HMGA2的表达受mi R-217的负向调控。（4）hsa＿circ＿0002141在口腔鳞状细胞癌中高表达,可作为原癌基因,HMGA2的表达受hsa＿circ＿0002141的正向调控,hsa＿circ＿0002141在口腔鳞状细胞癌中高表达,可作为基因研究靶点,其作用机制可能为:hsa＿circ＿0002141海绵吸附mi R-217,使下游靶基因HMGA2的表达增加,激活内质网应激途径,诱导自噬与凋亡通路,发挥抑癌作用。（5）抑制hsa＿circ＿0002141后能显著抑制人口腔鳞癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的生长。