本研究旨在探讨应用人NT-3基因转染的雪旺细胞(SchwannCells，SCs)与维甲酸(retinoicacid，RA)体外预诱导神经干细胞(neuralstemcell，NSCs)分化并联合移植对大鼠全横断脊髓损伤的治疗作用，从而为急性脊髓损伤的治疗探索一种新策略，本研究共分为四个部分。 第一部分神经干细胞和雪旺细胞的体外培养、纯化及鉴定 目的 改良出一种快速、简单、经济而又能得到足够纯度、足够量的NSCs和SCs的细胞培养方法，为研究应用NSCs和SCs提供稳定、可靠的细胞来源。方法选用SD乳鼠，取海马组织，用胰酶消化法和机械吹打法培养NSCs；取坐骨神经和臂丛神经，用单细胞双酶消化法和半植块单酶消化法培养SCs。结果用同样多的材料，机械吹打法所获得的NSCs是胰酶消化法所获细胞的四倍，省时至少20min，免疫组化结果显示获得的神经干细胞呈nestin阳性；用同样多的材料，半植块单酶消化法所获得的SCs比单细胞双酶消化法所获细胞至少多两倍，省时至少40min，免疫组化结果显示获得的雪旺细胞96％以上呈S-100阳性。结论用改良的机械吹打法培养NSCs；用单酶消化半植块法培养SCs，能在短时间内获得足够量、足够纯度、生长状态良好的NSCs和SCs。 第二部分雪旺细胞和维甲酸体外协同性促进神经干细胞向具有形成突触潜能的神经元方向分化 目的 研究体外联合应用SCs和RA对NSCs向具有形成突触潜能的神经元方向分化的作用。方法采用2×2析因设计方法，NSCs分别用RA，SCs和SCs+RA处理6d，所用培养液为含0.5％小牛血清的DMEM/F12。用免疫荧光双标来检测NSCs的分化情况，包括nestin，GFAP和Map2；PSD95的表达表明突触的发生。结果与对照组相比，用RA或SCs处理后，nestin和GFAP的表达显著下降，Map2的表达显著增加，用SCs处理后，PSD95的表达显著增加；析因设计的方差分析结果表明，SCs和RA在诱导Map2和PSD95的表达方面有显著性交互作用，且均有统计学意义。结论SCs和RA体外能协同性促进NSCs向具有形成突触潜能的神经元方向分化，但在减少nestin阳性NSCs，减少NSCs向胶质细胞分化方面只是一种附加作用。 第三部分体外联合应用人NT-3基因转染的雪旺细胞与维甲酸促进神经干细胞向具有形成突触潜能的神经元方向分化目的 研究体外联合应用人NT-3基因转染的SCs和RA对NSCs向具有形成突触潜能的神经元方向分化的作用。方法RT-PCR方法检测RA诱导前后NSCs中trkCmRNA的表达情况；扩增、纯化重组腺病毒，并检测病毒滴度，用腺病毒载体介导的人NT-3基因(AdvNT-3)转染SCs，用免疫组织化学法和ELISA法检测NT-3的表达和分泌。NSCs分别用SCs，SCs+RA，AdvLacZ-SCs，AdvNT-3-SCs，AdvNT-3-SCs+RA和AdvLacZ-SCs+RA处理6d。用nestin、GFAP、Map2和PSD95免疫荧光双标法来检测NSCs的分化情况。结果1.NSCs在RA诱导前后都有TrkC受体mRNA的表达；2.通过扩增、纯化获得了较高滴度的两种重组腺病毒，至少达到1010pfu/ml；3.重组腺病毒载体能有效的转染46.82％的雪旺细胞；4.在人AdvNT-3转染第4、7、14d时每105细胞24h内分别可以产生约35.21±7.40ng、24.05±3.47ng、14.16±1.11ng的人NT-3因子。5.与SCs，AdvLacZ-SCs，SCs+RA组相比，用AdvNT-3-SCs处理后，能显著性减少GFAP的表达，能显著性增加Map2和PSD95的表达；与其他组相比，用AdvNT-3-SCs+RA处理后，nestin和GFAP的表达显著下降，Map2和PSD95的表达显著增加，且均有统计学意义。结论联合应用人NT-3基因转染的SCs和RA能进一步促进NSCs向具有形成突触潜能的神经元方向分化，同时减少nestin阳性NSCs，减少NSCs向胶质细胞的分化。 第四部分应用人NT-3基因转染的雪旺细胞与维甲酸体外预诱导神经干细胞分化并联合移植治疗大鼠全横断脊髓损伤的实验研究目的 探讨应用人NT-3基因转染的雪旺细胞与维甲酸体外预诱导神经干细胞分化并联合移植对大鼠全横断脊髓损伤的治疗作用。方法取成年雌性SD大鼠37只，随机分为5组，分别为：1.体外分化组，用人NT-3基因修饰雪旺细胞与维甲酸体外预诱导神经干细胞分化6d后再联合移植；2.体外分化对照组，用LacZ基因修饰的雪旺细胞与维甲酸体外预诱导神经干细胞分化6天后再联合移植；3.体内分化组，将人NT-3基因修饰雪旺细胞与神经干细胞联合移植后使神经干细胞在体内分化；4.实验对照组，脊髓全横断后仅填充吸附培养液的明胶海绵；5.正常对照组，不做手术。采用脊髓胸10段全横断损伤模型，于全横断后在脊髓损伤处以明胶海绵为支架立即进行细胞移植，各组神经干细胞在移植前分别用Hoechst33342进行标记。术后53d时，在皮质体感区进行BDA顺行标记；术后60d时，分别进行BBB评分和爬网格测验，观察各组大鼠后肢运动功能的恢复情况；术后61d时，在脊髓横断下方胸12节段进行FG逆行标记；术后68d时进行灌注固定、取材及形态学观察。结果1.中性红染色后计数发现，与实验对照组相比，各细胞移植组大脑皮质体感运动区内锥体细胞层、中脑红核、及脊髓L1背核存活神经元数目均显著增多，并有统计学意义。2.NT-3免疫荧光化学染色结果显示，基因修饰SCs移植到损伤脊髓2个月后仍能表达外源基因。3.三个细胞移植组的脊髓横断处损伤区均检测到由移植神经干细胞分化来的Map2、NF、GFAP、PSD95、synapsin、ChAT染色阳性的细胞，并能检测到nestin双标阳性的细胞，其中Map2阳性细胞百分率，体外分化组最高，体内分化组最低，体外分化对照组介于两者之间，三组之间两两相比均有统计学意义。4.与实验对照组相比，三个细胞移植组的脊髓横断处及附近，均可看到多少不等的Map2、NF-200、GAP-43、5-HT阳性神经纤维，脊髓横断处检测到少量BDA阳性神经纤维，但其尾侧却没有，在中脑红核和脊髓横断处头侧端有少量神经元被FG标记。5.在三个细胞移植组的脊髓横断处MBP的表达缺如范围明显减少，CSPG的表达明显减少。6.行为学检测结果表明三个细胞移植组对脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复都有比较显著的促进作用，与体外分化对照组相比，体外分化组大鼠后肢运动功能恢复更好一些，并有统计学意义。7.电镜下，在细胞移植组中脊髓损伤处有少量再生的神经纤维轴突由厚薄不均的新生髓鞘包绕。结论应用人NT-3基因转染的雪旺细胞与维甲酸体外预诱导神经干细胞分化6d后再联合移植于大鼠全横断脊髓损伤处，能促进脊髓损伤区内神经干细胞向神经元方向的分化，并促进损伤脊髓结构和功能的修复。