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目的:基于兔颅骨缺损动物模型,采用骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)为种子细胞,Bio-oss为支架材料,复合培养植入兔颅骨缺损,对比观察复合物组,Bio-oss组,BMSCs组,空白组成骨效果。观察组织工程骨修复兔颅骨缺损的过程、效果,为骨组织工程(Bone tissue engineering,BTE)的临床应用提供参考。方法:分离培养雄性日本大耳兔BMSCs,将其作种子细胞,在雌性日本大耳兔颅骨采用一致的外直径6mm的环形骨钻制造全层骨缺损3个。共计32只雌性日本大耳兔,每组8只。将兔随机分A、B、C、D四组,植入不同材料,A组:复合物组(植入Bio-oss复合BMSCs),B组:单纯Bio-oss组(植入Bio-oss),C组:单纯BMSCs组(植入BMSCs),D组:空白组。ABCD组表面均覆盖引导组织再生(Guided tissue regeneration,GTR)膜。分别于2、4、8、12周四个时间节点处死,每组每个时间节点处死2只。标本检测:大体观察,X线检测,组织学及组织形态分析,A组及C组行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测。结果:1.通过抽取雄性兔骨髓(bone mesenchymal,BM),经密度梯度离心法结合贴壁筛选法可获得BMSCs,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测BMSCs高表达CD44:96.8%,低表达CD45:0.8%。BMSCs经成骨诱导后向成骨细胞分化,细胞形态转变,体积逐渐增大,出现肥大梭形细胞及不规则多角形细胞,多角形细胞逐渐增多,未见明显接触抑制。细胞诱导三周后,甲苯胺蓝染色见实验组细胞出现蓝黑色颗粒,有深蓝色钙化结节影,呈强阳性,对照组弱阳性。茜素红染色,实验组见明显红色钙结节,对照组未见钙结节。2.实验动物一般情况:动物无死亡,无活动异常,切口处未见明显红肿、炎症、感染。3.大体观察见:AB组2、4、8、12周均可见Bio-oss颗粒,2、4、8周时较明显,12周时仍可见Bio-oss颗粒,但较前三个时间点更少,2周及4周时质中,周界清,缺损充填处表面粗糙颗粒状。8周时,质较硬,周界较模糊(欠清晰),表面较光滑,12周时,质硬,周界模糊,表面较光滑。CD组可见新生组织向心性生长,2周及4周均见新生组织质软,周界较清晰,表面光滑,4周新生组织面积较2周增大。8周时C、D组新生组织质中,周界模糊,表面光滑且稍凹陷,C组新生组织面积较4周增大,中央仍有少量缺损,12周时C组及D组已无组织缺损,新生组织质稍硬,C组较D组稍硬,周界模糊,表面光滑稍凹陷。各组GTR膜均未见明显移位,2周时可见GTR膜基本完整,4周时明显较2周薄,8周时降解更加明显,仅少部分存留,12周时已基本完全降解。4.X线检查见:AB组4个时间节点均可见骨缺损处高密度阻射影,2周时,边界清晰,4周时,颗粒感降低,边界稍模糊,8周时,材料与自体骨界限变模糊。12周时,边界较8周更加模糊不清,CD组可见骨缺损向心性融合生长,C组2、4、8、12周新生组织长入分别约0.4mm、1mm、1.5mm、2.5mm,D组2、4、8、12周新生组织长入分别约0.4mm、0.8mm,1mm,2mm,CD组2、4周时密度明显低于自体骨,边界较明显,8周时密度稍低于自体骨,边界较模糊,12周时密度稍低略自体骨,界限模糊。边界较明显。5.HE染色:缺损处观察见,AB组受区Bio-oss不断降解,胶原纤维增生,2周时材料周围见明显的炎症细胞浸润,丰富的毛细血管,4周开始类骨质明显增多,8、12周骨质不断成熟、矿化,新生血管增多。CD组2周见大量胶原纤维增生,炎症细胞浸润,毛细血管丰富。4周少量类骨质生成,少量新生血管,8、12骨质不断沉积、矿化。对新生骨面积统计结果示,按时间节点分组统计,术后2周,ABCD组之间无明显差异;术后4周,AB组优于C组(P<0.05)及D组(P<0.05);术后8周,A组优于B组(P<0.05)及CD组(P<0.05);术后12周;A组优于CD组(P<0.05)。按ABCD四组分组统计,随着时间的延长,新骨量逐渐增多,A组,4、8、12周均多于2周(4周>2周:P<0.05,8周>2周:P<0.01,12周>2周:P<0.01),8周多于4周(P<0.05);B组,4、12周多于2周(P<0.05);C组,8周多于2周(P<0.05),12周多于2周,(P<0.05);D组,8周多于2周(P<0.05),12周多于2周(P<0.05)。6.Masson染色:鉴定骨质成熟程度,成熟骨红染多。AB组术后2周受区见大量淡红色Bio-oss颗粒,4周Bio-oss逐步被纤维结缔组织分割,材料边缘逐渐转红,8周Bio-oss进一步降解,红染渐增多,但排列紊乱,12周红染区域进一步扩大且颜色逐渐加深。CD组术后2周大面积蓝染,4周仍主要为蓝染。8周开始出现较为明显的红染区域,多数仍为淡红色,12周红染区域进一步扩大。测量平均光密度值后统计示:按时间节点,术后2周,ABCD组之间无显著差异;术后4周,A组优于C、D组(A>C:P<0.05;A>D:P<0.05);术后8周,A组优于BCD组(A>B:P<0.05;A>C:P<0.05;A>D:P≤0.01),B组优于D组(P<0.05);术后12周,A组优于BCD组(A>B:P<0.05;A>C:P<0.05;A>D:P<0.05)。按ABCD四组分组统计,随着时间的延长,新生骨逐渐增多且逐步成熟矿化,A组,4、8、12周均高于2周(4周>2周:P<0.05,8周>2周:P<0.05,12周>2周:P<0.01),8、12周高于4周(8周:P<0.05,12周:P<0.05);B组,4、8、12周高于2周(4周:P<0.05,8周:P<0.01,12周:P<0.01),8、12周高于4周(8周:P<0.05,12周:P<0.05),12周高于8周(P<0.05);C组,4、8、12周均高于2周(4周:P=0.017<0.05,8周:P=0.002<0.01,12周:P=0.002<0.01),8、12周高于4周(8周>4周:P<0.05,12周:P<0.05);D组,4、8、12周均高于2周(4周:P=0.023<0.05,8周:P≤0.01,12周>2周:P<0.01),8、12周高于4周(8周:P=0.040<0.05,12周:P<0.05)。结合大体观察、X线检测、HE及Masson染色结果,综上所述,成骨效果A组较B、C、D组更佳,B组优于CD组,CD组无明显差异。对四组而言,随时间延长,骨量逐渐增多,骨质逐渐成熟。5.Y染色体检测:雄性兔的Y染色体性别决定基因(Sex-determining Region on the Y Chromosome,SRY)在四个时间节点的A组及C组均呈阳性表达。结论:1.密度梯度离心法结合贴壁筛选法可提取到兔BMSCs,经过培养、传代可纯化细胞。2.BMSCs经成骨诱导后向成骨细胞分化,可作为BTE理想的种子细胞。3.干细胞移植可选用SRY基因做示踪。4.Bio-oss物理及化学性能与天然骨类似,生物相容性良好,可作为BTE良好的生物支架材料。5.以Bio-oss作为支架材料,BMSCs作为种子细胞复合植入兔颅骨有明显的促进成骨作用,为临床骨缺损的治疗提供了一个新的思路。