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研究背景与目的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国高发的恶性肿瘤之一目前全球每年新增HCC患者约56万,其中约一半病例出现在我国,且其死亡率从我国恶性肿瘤死亡率的第三位跃居至第二位。目前尚无有效的治疗手段,即使行手术、化疗等综合治疗,预后仍然极差。据统计,即使是小于5cm的小肝癌行手术治疗,术后3年的复发率仍高达50%以上。其预后差的主要原因是：HCC具有极强的侵袭转移能力。侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为。肿瘤的侵袭转移是一个多环节、多阶段的过程,它包括肿瘤细胞与周围细胞和细胞外基质分离、游出,穿过血管基底膜进入血循环,随血液到达靶器官,再次从血管壁渗出进入靶器官,局部增殖成为转移瘤,是涉及到多个信号通路功能、多个基因激活／失活的复杂过程。对肝癌侵袭转移相关分子机制的研究,有助于寻找新的干预靶点,改善肝癌的疗效和预后。细胞与周围细胞以及细胞外基质之间信号传递异常,导致二者之间黏附特性发生改变,是促进肿瘤侵袭转移启始的重要因素之一。连接蛋白(connexin,Cx)由多基因家族编码的一类膜蛋白家族,哺乳动物中发现二十种此类膜蛋白,是细胞间缝隙连接(gap junction, GJ)的基本结构单位。其中连接蛋白32 (Connexin 32, Cx32)是人类肝脏中表达的主要连接蛋白,也是肝细胞缝隙连接的主要组分。缝隙连接是细胞膜上的特殊结构,也是相邻细胞间唯一能直接进行物质交换和信息传递的通道。细胞能通过缝隙连接胞间通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)进行细胞间信息和能量的传递,调控细胞的生长和分化,并维持内环境的稳定。有研究表明,Cx32蛋白在多种肿瘤组织中的表达下调,其表达下调及相关信号传导通路的紊乱可能导致相邻细胞间GJIC异常,学者们认为这可能是肿瘤发生的重要机制之一。另有学者采用显性负相技术在动物实验中证实Cx32对于致癌物二乙基亚硝胺(DEN)诱导的肝癌早期和晚期均有抑制作用。这提示Cx32可能调控肝癌细胞的侵袭转移。但目前尚未在细胞水平得到验证,且关于Cx32调控肿瘤细胞侵袭的分子机制研究甚少。因此,本课题选择Cx32作为分子靶,拟从组织和细胞水平深入研究Cx32在HCC侵袭转移中的作用及其相关机制,为充实肝癌侵袭转移的理论提供实验基础。方法收集同济医院肝外科HCC手术切除标本(经术后病理证实)20例,采用RT-PCR、Western blot方法检测人肝癌和癌旁组织中Cx32基因核酸和蛋白表达的相对水平,探讨Cx32基因与人HCC发生发展的关系。培养三株不同转移潜能的人肝癌细胞株Hep G2、MHCC-97L以及MHCC-97H,采用RT-PCR、Western blot方法检测细胞株中Cx32基因核酸和蛋白表达的相对水平,并分析其表达与肝癌细胞株转移潜能的相关性。用pcDNA3.1(-)质粒构建Cx32的真核表达载体,应用脂质体将其转染至低表达Cx32的人肝癌细胞株MHCC-97H,用pGensil-2质粒构建Cx32-shRNA的真核表达载体,应用脂质体将其转染至相对高表达Cx32的人肝癌细胞株Hep G2,通过G418筛选出稳定高表达Cx32的MHCC-97H细胞株、Cx32表达受抑制的Hep G2细胞株,采用Western blot检测细胞株中Cx32基因的蛋白表达水平,采用划痕标记荧光传输试验显示细胞胞间通讯功能的变化,采用Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变。采用Western blot法检测Cx32表达受抑制的Hep G2细胞株中细胞膜蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表达的变化。用pGensil-2质粒构建Notchl-shRNA的真核表达载体,应用脂质体将其转染至人肝癌细胞株MHCC-97H,通过G418筛选出Notchl表达受抑制的MHCC-97H细胞株,采用Westernblot方法检测细胞株中Notchl基因的蛋白表达水平,同时给予缝隙连接阻滞剂甘琥酸孵育,采用划痕标记荧光传输试验显示细胞胞间通讯功能的变化,采用Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变。结果1. RT-PCR、Western blot检测结果显示,Cx32基因mRNA的相对表达量在人肝癌和癌旁组织中分别为0.1600±0.0793、0.3169±0.0821,蛋白的相对表达量在癌和癌旁组织中分别为0.5564±0.1735、0.8720±0.1321,Cx32基因mRNA和蛋白的表达水平在肝癌组织较癌旁组织明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；在三株不同转移潜能的人肝癌细胞株Hep G2、MHCC-97L以及MHCC-97H中,Cx32基因mRNA表达的相对水平分别为0.3023±0.0401、0.1829±0.02760、0.0746±0.0106,蛋白表达的相对水平分别为0.5972±0.08831、0.2866±0.03280、0.1544±0.02354,均有显著性差异(P<0.05),且随人肝癌细胞株转移潜能的降低而增高。2.成功构建pcDNA 3.1(-)/Cx32真核表达载体,稳定转染pcDNA 3.1(-)/Cx32真核表达载体可使MHCC-97H细胞中Cx32蛋白表达(1.2996±0.1641)较空载体转染组(0.5097±0.04927)和空白对照组(0.4964±0.08969)明显增强(P<0.05)。与对照组和转染空质粒组细胞相比,转染pcDNA 3.1(-)/Cx32真核表达载体、过表达Cx32的细胞胞间通讯功能增强,细胞迁移和侵袭实验中穿膜细胞数分别为159.3±14.0个、69.7±6.8个,均较对照组(213.3±17.6个、102.0±12.5个)和空载体转染组(209.0±16.5个、96.0±10.5个)减少(P<0.05)3.成功构建Cx32-shRNA真核表达载体,转染Cx32-shRNA真核表达载体,可使Hep G2细胞的Cx32蛋白表达较对照组和空载体转染组降低67.4%。与对照组和转染空质粒组细胞相比,转染Cx32-shRNA真核表达载体、Cx32表达受抑制的细胞胞间通讯功能增强,而细胞迁移和侵袭实验的穿膜细胞数分别为198.3±18.5个、116.0±10.5个,均高于对照组(148.7±14.0个、79.3±8.5个)和空载体转染组(137.3±14.6个、76.3±6.5个) (P<0.05)。4.成功构建Cx32-shRNA真核表达载体,转染Cx32-shRNA真核表达载体,使得Hep G2细胞的Cx32蛋白表达下调67.4%。转染Cx32-shRNA真核表达载体、Cx32表达受抑细胞的胞膜上紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1以及ZO-1的相对量分别为0.2675±0.03958、0.4213±0.02933、0.1319±0.00857,均低于对照组(0.414±0.03677、1.0472±0.1095、0.4573±0.03507)和空载体转染组(0.4279±0.03958、1.1145±0.1325、0.4682±0.04186：P<0.05)5.成功构建Notchl-shRNA真核表达载体,Notchl-shRNA真核表达载体转染至MHCC-97H细胞后,Notchl蛋白表达受抑制(抑制率60.78%)。与空白对照组和转染空载体组细胞相比,转染Notchl-shRNA真核表达载体、Notchl表达受抑制的细胞胞间通讯功能增强,而细胞迁移和侵袭实验的穿膜细胞数分别为85.7±6.0个、45.7±5.5个,低于对照组(215.7±15.6个、112.0±12.1个)和空载体转染组(204.7±15.5个、106.0±9.5个)(P<0.05)。同时给予缝隙连接阻滞剂孵育细胞,则穿膜细胞数升至119.3±10.1个、63.3±6.1个,但仍低于空白对照组(P<0.05)。结论Cx32基因在人HCC癌组织和人肝癌细胞株中均出现低表达,并随人肝癌细胞株转移潜能的降低而增高。过表达Cx32能使人肝癌细胞株的细胞通讯功能增强,侵袭能力下调；抑制人肝癌细胞株Cx32的表达则可抑制其细胞通讯功能,而促进细胞的侵袭能力。验证了Cx32可调控人肝癌细胞的侵袭能力。进一步探讨Cx32调控人肝癌细胞侵袭能力的分子机制时,我们发现,抑制人肝癌细胞株Cx32的表达使得紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1在细胞膜的分布减少,表明Cx32可能通过影响紧密连接蛋白调控人肝癌细胞的侵袭能力。抑制人肝癌细胞株Notchl的表达,可使细胞通讯功能恢复,细胞侵袭能力降低;而同时孵育缝隙连接阻滞剂甘琥酸则可部分逆转Notchl下调导致的细胞侵袭能力受抑。这提示Cx32可能对Notch信号通路调控的肝癌细胞侵袭迁移有一定影响作用。综上所述,Cx32基因可能是通过缝隙连接抑制肝癌细胞的侵袭能力,并对Notch信号通路调控的细胞侵袭迁移有一定作用。这提示我们Cx32基因也可能是影响肝癌侵袭能力的一个有效分子靶。