论文部分内容阅读
背景卵巢癌是发生于女性生殖器官的恶性肿瘤之一。虽然发病率相对较低,但其导致的死亡率逐年升高,尤其是在中国等发展中国家。引起高死亡率的主要原因是卵巢恶性肿瘤易发生转移,尤其出现腹腔脏器的播散,许多卵巢癌患者就诊时病情已至晚期(国际妇产科联合会(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)定义的III期和IV期),这给卵巢癌的治疗和预后改善带来很大困难。研究报道,血小板与卵巢癌的转移有关。相比于血小板正常的卵巢癌患者,伴有血小板增多的卵巢癌患者更容易出现肿瘤播散。但血小板增强卵巢癌细胞侵袭转移能力的具体机制尚不清楚。近来研究表明,发生上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是恶性肿瘤细胞侵袭能力改变的关键步骤。许多细胞外因子可以引起肿瘤细胞发生EMT,例如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。该分子激活多条通路诱导细胞发生EMT,其中最重要的是磷酸化Smad分子后激活的TGF-β/Smad通路。由于血小板活化后能分泌大量的TGF-β,因此本研究推测血小板可以通过激活TGF-β通路诱导卵巢癌细胞发生EMT,从而增强其侵袭能力。为了证实这一猜测,本研究首先将血小板同卵巢癌细胞共同孵育,观察其侵袭能力的改变。然后从基因和蛋白水平分析血小板处理后的细胞内EMT相关分子的改变。接着本研究检测经血小板处理后卵巢癌细胞培养基中TGF-β含量的变化,以及细胞中磷酸化Smad水平的变化,以分析血小板处理的卵巢癌细胞中TGF-β/Smad通路的活化情况。最后,本研究使用一种名为A83-01的TGF-β受体拮抗剂,通过细胞和小鼠实验来观察抑制TGF-β通路后是否影响血小板对卵巢癌细胞的作用。另外,本文还探究了血小板和常用凝血指标在卵巢癌和其他肿瘤中的临床应用价值。材料和方法本研究主要分为三个部分。在第一分部中本研究纳入在中国医学科学院肿瘤医院就诊的85名卵巢肿瘤患者,包括卵巢良性肿瘤患者16名,卵巢癌患者69名。检测其术前血小板水平,记录其肿瘤分级和分期等临床病理信息。比较血小板与卵巢癌患者临床病理信息的关系。分离出健康人员血小板后,将其同SK-OV-3和OVCAR-3卵巢癌细胞共同孵育,观察其形态变化,并通过Transwell实验检测卵巢癌细胞侵袭能力的改变。通过芯片、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blot技术检测血小板处理后卵巢癌细胞EMT相关分子的变化。在第二部分中,本研究检测纳入的卵巢癌患者体内TGF-β水平,比较血小板增多的卵巢癌患者与血小板正常的卵巢癌患者之间TGF-β是否存在差异。检测血小板处理后卵巢癌细胞培养基中TGF-β含量。检测血小板处理后细胞中磷酸化Smad2(pSmad2)分子的表达情况。使用TGF-β受体拮抗剂A83-01处理卵巢癌细胞后,检测血小板激活的EMT和TGF-β通路是否被抑制。向裸鼠腹腔内注射血小板和(或)A83-01,观察A83-01是否抑制卵巢癌细胞在裸鼠腹腔的播散,并通过免疫组化染色技术检测裸鼠腹腔瘤体中EMT相关分子的改变。在第三部分中,本研究本研究分析了来自中国医学科学院肿瘤医院156名卵巢肿瘤患者术前血小板计数(platelets,PLT)、白细胞计数(white blood cell count,WBC)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)、D-二聚体、纤维蛋白(原)降解产物(fibrin(ogen)degradation products,FDP)、纤维蛋白原(fibriongen,FIB)和糖类抗原 125(carbohydrate antigen 125,CA125)等指标。156名卵巢肿瘤患者包括30名良性卵巢肿瘤患者和126名卵巢癌患者,比较血小板和常用凝血指标在辅助鉴别卵巢肿瘤良恶性以及卵巢癌早晚期中的应用。另外,本研究也分析在中国医学科学院肿瘤医院就诊的86例结直肠癌患者术前 PT、APTT、TT、D-二聚体、FDP、FIB、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)等指标。其中 43 例患者为Ⅰ期和Ⅱ期,43例患者为Ⅲ期。还纳入92例Ⅳ期结直肠癌患者,其中65例患者发生肝转移,23例发生肺转移(4例合并肝和肺转移),11例发生其他器官转移(脑、骨和脾),这92例患者之前均为Ⅰ期至Ⅲ期患者,在中国医学科学院肿瘤医院接受手术治疗,并在之后复查过程中发现出现远端器官转移。检测发生远端转移时结直肠癌患者PT、APTT、TT、D-二聚体、FDP、FIB、CEA和LDH等指标。比较常用凝血指标在辅助鉴别结直肠癌早期晚期以及是否发生远端器官转移中的应用。结果在第一部分研究中,以350×109/1为cut off值,本研究将卵巢癌患者分为血小板正常组和升高组,33名卵巢癌患者纳入血小板升高组。相比于血小板正常组,在血小板升高组中有更多卵巢癌患者出现大网膜、肠系膜和腹膜等腹腔部位的播散。本研究还发现血小板使卵巢癌细胞表现出间质形态,使穿出Transwell小室的细胞数量显著增加。芯片、qPCR和Western blot结果显示,血小板使卵巢癌细胞中侵袭相关分子表达显著升高,而粘附相关分子表达显著下降。在第二部分,本研究发现血小板升高组中卵巢癌患者TGF-β水平显著升高。血小板使培养基中TGF-β水平显著升高,使卵巢癌细胞中pSmad2水平显著增加。A83-01显著抑制血小板诱导的EMT,降低卵巢癌细胞侵袭能力。血小板促进卵巢癌细胞在裸鼠腹腔播散,A83-0显著抑制该现象,并逆转腹腔瘤体中发生的EMT。第三部分研究发现,相比于良性肿瘤患者,卵巢癌患者体内PLT、D-二聚体、和FDP显著升高,在卵巢良性肿瘤和卵巢癌的鉴别中,D-二聚体和FDP的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积(area under curve,AUC)大于PLT。相比于早期卵巢癌患者,晚期卵巢癌患者PLT、D-二聚体和FDP显著升高,在早期卵巢癌和晚期卵巢癌的鉴别中,D-二聚体和FDP的AUC大于PLT。相比于(Ⅰ期+Ⅱ期)结直肠癌患者,(Ⅲ期)结直肠癌患者术常用凝血指标变化无统计学意义,但当其发生远端器官转移时,D-二聚体水平显著升高。在结直肠癌有无远端器官转移的鉴别中,D-二聚体的AUC大于CEA或LDH。结论伴有血小板增多的卵巢癌患者更易发生肿瘤的腹腔转移。细胞实验证实,血小板通过诱导卵巢癌细胞发生EMT增强其侵袭能力。血小板激活卵巢癌细胞内TGF-β/Smad通路,而TGF-β受体拮抗剂A83-01抑制血小板对卵巢癌细胞的促进转移作用,因此血小板通过TGF-β诱导卵巢癌细胞发生EMT并增强其侵袭能力。在卵巢良性肿瘤和卵巢癌的辅助判断中,D-二聚体和FDP优于血小板。对于早期卵巢癌和晚期卵巢癌的辅助判断中,D-二聚体和FDP的变化优于血小板。在结直肠癌中,联合D-二聚体和CEA与LDH,可提高发现远端器官转移的效能。