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目的:研究γδT细胞对MM(multiple myeloma,骨髓瘤)细胞的杀伤作用和对im DCs(immature dendritic cells,未成熟树突状细胞)转分化为OCs(osteoclast cells,破骨细胞)的抑制作用。方法:(1)采集健康志愿者外周血,经淋巴细胞分离获得PBMNCs(peripheral blood mononuclear cells,外周血单个核细胞),并在1μM Zol(zoledronate,唑来膦酸)和200 IU/ml rh IL-2(recombinant human interleukin-2,重组人白介素-2)的条件下扩增获得γδT细胞,免疫磁珠法分选培养至第7天的γδT细胞;(2)收集生长状态良好的MM 8226细胞株,与磁珠分选获得的γδT细胞共培养4小时,通过LDH(lactate dehydrogenase,乳酸脱氢酶)法检测γδT细胞对MM 8226细胞株的杀伤作用;并比较分别用10μg/ml抗人γδTCR m Ab(monoclonal antibody,单克隆抗体)、抗人NKG2D m Ab、抗人γδTCR m Ab+抗人NKG2D m Ab及抗鼠Ig G m Ab封闭后的γδT细胞对MM 8226细胞株的杀伤作用;(3)免疫磁珠法分选获得CD14+单个核细胞,在rh IL-4(recombinant human interleukin-4,重组人白介素-4)和GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的作用下分化为im DCs,后者在M-CSF(macrophage colony stimulating factor,巨噬细胞集落刺激因子)和s RANKL(soluble nuclear factor kappa B predominate ligand receptor activation factors,可溶性细胞核因子κB受体活化因子配体)共同作用下转分化为具有骨吸收作用的OCs;(4)免疫磁珠分选获得的γδT细胞与CD14+单个核细胞经im DCs途径转分化为OCs的各个阶段,通过直接和间接接触的方式以不同比例共培养至第14天,通过TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase,抗酒石酸酸性磷酸酶)染色观察γδT细胞对OCs生成数量的影响;(5)将抗体封闭后的γδT细胞与im DCs以10:1的比例直接共培养至第14天,通过TRAP染色观察生成OCs的情况;(6)收集不同培养组上清液,通过ELISA方法检测不同阶段、不同比例上清液中IFN-γ(interferon-γ,干扰素-γ)和CTX-I(Type I collagen end Carboxy-terminal peptide,I型胶原C-末端肽)浓度变化。结果:(1)证实体外条件下可通过Zol和IL-2扩增获得γδT细胞;(2)γδT细胞与MM 8226细胞株按效靶比为10:1、1:1、1:10混合培养4小时,γδT细胞对其杀伤率分别为41.69%、26.88%、9.97%,显示γδT细胞对MM细胞具有杀伤作用,且呈剂量依赖性;分别用抗人γδTCR m Ab、抗人NKG2D m Ab、抗人γδTCR m Ab+抗人NKG2D m Ab及抗鼠Ig G m Ab封闭γδT细胞后,将γδT细胞与MM 8226细胞株按10:1的效靶比混合培养时,各组杀伤率分别为21.56%、26.86%、14.93%、42.03%,显示TCR-γδ途径被阻断后,γδT细胞对MM 8226细胞株的杀伤力减低,且比NKG2D途径阻断后的杀伤率减低更明显;(3)γδT细胞与CD14+PBMNCs直接共培养组中基本见不到TRAP染色阳性细胞;间接共培养组中,当两者比例为1:5时,TRAP染色阳性多核巨细胞数为8.33±2.08(x±S)个/10个视野,远低于CD14+PBMNCs单独培养组(37.67±2.05个/10个视野)(p<0.05);γδT细胞与im DCs直接共培养组中,两者比例分别为1:10、1:1、10:1时,TRAP染色阳性的多核巨细胞数目分别为14.33±2.08个/10个视野、9.67±2.52个/10个视野、3.33±1.53个/10个视野,各组之间以及与im DCs单独培养组(37.67±2.05个/10个视野)之间比较,OCs均生成减少(p值均小于0.05),差异具有统计学意义;而在γδT细胞与im DCs间接共培养组中,两者比例分别为1:10、1:1、10:1时,TRAP染色阳性的多核巨细胞数目分别为24.67±2.08个/10个视野、15.53±1.33个/10个视野、7.67±0.58个/10个视野,各组与im DCs单独培养组之间差异亦具有统计学意义(p值均小于0.05);γδT细胞与OCs直接或间接共培养组中,均可见到已经生成的OCs被溶解、皱缩,并显示相同比例的两种细胞共培养,直接混合培养相对间接共培养,γδT细胞对各个阶段的抑制作用更明显;并且,γδT细胞对im DCs转分化为OCs过程中的抑制作用呈剂量依赖性,随着γδT细胞比例的增高,其抑制作用相对更明显;(4)抗人γδTCR m Ab、抗人NKG2D m Ab、抗人γδTCR m Ab+抗人NKG2D m Ab及抗鼠Ig G m Ab封闭后的γδT细胞与im DCs以10:1直接共培养时,TRAP染色阳性的多核巨细胞数目(2.33±0.47个/10个视野)并未比相同比例的无抗体封闭培养组(3.33±1.53个/10个视野)数目增加,显示抗体封闭并未对γδT细胞抑制OCs生成的过程产生影响(p>0.05);(5)γδT细胞与im DCs共培养比例分别为1:1、5:1、10:1时,培养24小时后直接共培养组上清中IFN-γ的浓度分别为617.09 pg/ml、900.1 pg/ml、1277.34 pg/ml,间接共培养组浓度分别为509.68pg/ml、786.49 pg/ml、1045.5 pg/ml。显示随着γδT细胞比例的增高,其分泌IFN-γ的能力亦随之增高,且im DCs与γδT细胞直接共培养相对间接共培养来说,im DCs刺激γδT细胞分泌IFN-γ的能力更明显;当两种细胞比例为1:1时,γδT细胞与CD14+单个核细胞共培养时,CTX-I基本不分泌;与im DCs以1:1比例共培养时,直接接触共培养上清液中CTX-I的水平(397.01 pg/ml)低于间接接触共培养组(459.47 pg/ml);γδT细胞与OCs作用24小时后,直接共培养组上清液中检测不到CTX-I,间接组的水平(83.245 pg/ml)低于OCs单独培养组(889.54 pg/ml),差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:(1)体外培养条件下,γδT细胞具有杀伤MM细胞的作用,其机制可能与其表面TCR和NKG2D受体介导的信号通路有关;(2)γδT细胞可在OCs分化发育的各个阶段抑制OCs的生成并溶解成熟OCs,其抑制作用的机制并不与细胞表面TCR和NKG2D受体介导的途径有关;(3)IFN-γ可能在γδT细胞抑制OCs生成的过程中发挥作用。因此,γδT细胞有希望成为MM细胞免疫治疗的一种选择。