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红霉素A(erythromycin A，ErA)的生物合成需要经过两次羟基化后修饰,第一次羟基化发生在6-脱氧红霉内酯B(6-deoxyerythronolide B,6-dEB)的C-6位,由羟基化酶EryF催化;第二次羟基化发生在红霉素D(erythromycin D,ErD)的C-12位,由羟基化酶EryK催化完成,EryK和EryF同属细胞色素P450单加氧酶家族,该类酶具有核心区域BC loop。编码EryK的基因eryK由Stassi等发现,其开放阅读框位于红霉素抗性基因ermE下游约50kb处,虽然EryK也能催化红霉素B(erythromycin B，ErB)的羟基化,但ErA的生物合成最佳路径是经红霉素D氧化到红霉素C(erythromycin C，ErC),再甲基化到ErA,在动力学上,其催化效率是ErD经ErB到ErA的1200～1900倍。 为了研究糖多孢红霉菌C-12羟基化酶EryK,本研究对EryK基因进行了克隆,并探讨了其在大肠杆菌中的最佳表达条件。将羟基化酶EryK基因eryK克隆到表达质粒pET-22b(+)中,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并就几个主要的表达条件(装液量、接种量、诱导时间、IPTG浓度和FeCl3浓度)进行了优化。SDS-PAGE显示,在相对分子质量44×103Da处有EryK蛋白条带,其含量占菌体总蛋白的58％以上。证明高GC含量的糖多孢红霉菌C-12羟基化酶基因eryK可以在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达,为体外研究EryK酶学相关性质以及大规模工业发酵奠定了基础。 为进一步研究EryK的酶学性质和在红霉素生物合成中的作用,本实验通过重叠PCR将EryK基因中包括BC loop在内的关键氨基酸序列删除,克隆到同源重组质粒pWHM3上,继而通过染色体同源重组方法将EryK羟基化酶基因失活,构建了缺失C-12羟基化酶活性的糖多孢红霉菌突变体。本实验利用基因工程方法,删除了糖多孢红霉菌A226染色体eryK中包括BC loop在内的关键氨基酸序列后,突变菌株AK17只产生红霉素B而不能产生红霉素A,并通过薄层层析、质谱、体内转化实验等方法加以验证,进一步证明了EryK在红霉素生物合成中的作用,为探讨P450单加氧酶EryK的酶学特性奠定了基础,对于通过定向诱导BC loop结构中的潜在位点,设计新的P450单加氧酶很有帮助,也为设计新型的酮内酯类抗生素提供了来源。