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纤溶性蛋白酶,是类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族中一类非常重要的碱性蛋白酶,它们具有很好的纤溶活性,广泛的存在于各种动物、昆虫和微生物中。目前,一些纤溶性蛋白酶已经被开发成用于治疗血栓病的药物。本文以蝎子和黄粉虫为研究对象,克隆了蝎子体内的纤溶性蛋白酶基因,同时在大肠杆菌BL21(DE3)体内成功的表达出了具有一定纤溶活性的黄粉虫纤溶性蛋白酶。作者根据一些已经被克隆出来的纤溶酶的氨基酸序列的保守区域,设计了一对简并性引物,然后克隆出了蝎子纤溶酶基因的部分保守片段。通过RACE法对该酶的3’端和5’端的DNA序列进行扩增,最后通过拼接得到了纤溶酶基因的全长序列。该序列全长1427bp,其中包括由1176bp个碱基组成的开放阅读框(ORF),编码了由391个氨基酸残基组成的蛋白质序列。通过BLAST在NCBI上做同源性比对,该酶与其他物种的纤溶酶的序列相似性在30%-45%之间。我们通过相关的软件对克隆到的序列进行分析,该酶的N端含有由18个氨基酸残基组成的信号肽,酶的分子量约为42KDa,具有典型的“催化三联体”结构。通过模拟它的三维空间结构,我们发现该酶在活性部位和底结合部位没有刚性的α螺旋和β折叠,说明该区域的柔性较高,这样有利于酶参与催化反应,符合“诱导契合”机制。我们采用pET32a+质粒构建表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)体内成功的表达了黄粉虫纤溶酶。通过对表达条件的研究,获得了如下的最佳培养条件：在LB液体培养基中,培养温度为30℃,在对数期生长中期(OD600约为0.6)添加终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导,250rpm条件下摇床诱导培养5h,即可获得一定含量的可溶性目的蛋白。由于大多数的蛋白是以包涵体的形式存在,所以我们采用尿素对包涵体进行变性处理,然后用GE HiTrap IMAC FF5mL纯化柱通过Ni2+与目的蛋白His标签的亲和层析来分离变性蛋白,最后在透析袋中对纯化到的变性蛋白进行复性。通过变复性处理,我们得到了纯度较高而且具有一定纤溶活性的表达蛋白。另外,本文也对黄粉虫纤溶酶的三维结构做了模拟。