用化学杂交剂(CHA)诱导植物雄性不育是杂种优势利用的重要方式之一,还可用于辅助育种等多种用途,但关键限制因素是新型高效CHA及其作用机理。本文以油菜为主要研究对象,验证乙酰乳酸合成酶(ALS,EC4.1.3.18)抑制型除草剂能筛选新型化学杂交剂的推断,并从生理机制上探讨化学杂交剂的作用特征及毒性机理,为开发新型CHA提供理论基础。得到的主要结果如下:1.CHA的筛选及效果评价1.1对于敏感性较高的油菜,本文所用26种除草剂中,22种可不同程度地诱导油菜雄性不育。从中筛选出2种效果最好的油菜化学杂交剂苯磺隆和酰嘧磺隆(发明专利ZL200610042886.1)。以0.2 mg/L-0.4 mg/L剂量处理甘蓝型油菜,产生95%-100%雄性不育率,两次喷药实现整个花期不育,药害程度较轻。苯磺隆或酰嘧磺隆处理能使3个环境敏感不育系达到完全不育,无明显药害。网室模拟化学杀雄制种试验所得杂交种的杂交率为98.2%。用CHA处理细胞质雄性不育系后制种种子纯度达到99.9%,表明CHA在化学杀雄制种和辅助三系制种方面具有很大应用潜力。苯磺隆也可以诱导芸薹属以及其他十字花科植物雄性不育,杀雄率能达到85%-100%。1.2对于单子叶植物小麦,本文所用多数麦田除草剂不能诱导雄性不育,只有咪草烟(专利申请号:200810231884.6)和草甘膦诱导雄性不育率均超过95%,但是草甘膦副作用较大。咪草烟对18个参试品种(系)的诱导雄性不育率都大于95%,剂量与品种之间有一定互作效应。咪草烟也能诱导禾本科的大麦、玉米达到100%不育。以上3种CHA的发现说明从磺酰脲类、咪唑啉酮类除草剂中筛选超高效CHA是可行的。2.化学杂交剂的靶标研究2.1酰嘧磺隆剂量与油菜下胚轴生长、ALS活性呈现显著负相关。在酰嘧磺隆处理油菜之后,ALS酶离体活性首先有小幅度升高,然后开始下降。表明ALS基因表达水平应激性提高,但随后蛋白合成整体水平下降导致ALS酶蛋白减少。不敏感品种82089酶活性稍高于敏感品种Qinyou3,且酶活力恢复快于Qinyou3。花蕾和雄蕊的ALS活力高于成熟叶片,但受酰嘧磺隆处理后下降幅度更大,这可能是CHA具有部位选择性的原因。采用不同ALS抑制剂处理油菜、小麦,杀雄活性高的除草剂对ALS活性抑制持续性大于杀雄效果差的除草剂,而高剂量的抑制效应又大于低剂量。表明这些CHA的作用靶标就是ALS。由于ALS是植物三种支链氨基酸合成途径的关键酶,通过ALS抑制剂中筛选、合成新型超高效CHA是可行的。2.2根据油菜乙酰乳酸合成酶基因设计16条引物,对16个品种的DNA模板进行扩增,发现ALS基因有多态性,但聚类结果不能清楚反映品种之间的遗传距离,也没有找到决定酰嘧磺隆敏感性的ALS基因位点。2.3酰嘧磺隆、酰嘧磺隆+支链氨基酸、环丙二羧酸(酮醇酸还原异构酶的特异抑制剂)三种处理都使得油菜花蕾游离氨基酸总量比对照提高1倍以上。说明CHA处理导致生长抑制,蛋白质的转换引起游离氨基酸总量变大,氨基酸比例失衡。对经过CHA处理的油菜植株,从叶面、花蕾等不同部位持续补给支链氨基酸,不能使育性恢复。3.酰嘧磺隆诱导油菜雄性不育的细胞学特征3.1用整体透明技术观察,酰嘧磺隆处理油菜具有接近正常的胚珠数量和发达的乳突结构,败育花药内小孢子数目减少,而且大都破裂变形。3.2诱导不育油菜的显微结构特征为:败育花药在小孢子发育早期不同阶段都有异常;花粉母细胞变形,细胞质收缩,出现空腔;四分体残缺不全;单核期小孢子畸形,细胞内容物基本消失。也有绒毡层异常膨大、绒毡层液泡化、提前解体或异常增生等现象。3.3超微结构显示:诱导不育油菜的部分花粉母细胞核膜破裂,核仁散碎,细胞质分解,体积收缩。部分花粉母细胞可以通过减数分裂,但产生的小孢子内有明显的线粒体、质体降解、吞噬等现象。绒毡层结构混乱,内容物残缺不全,没有绒毡层小体,造油体中颗粒呈破裂或者空瘪状。而且叶片、花药表皮、内壁细胞的叶绿体和质体空瘪,基粒片层破坏。4酰嘧磺隆诱导雄性不育的生理生化特征4.1酰嘧磺隆对油菜保护酶POD、CAT活性、以及体内毒素过氧化氢、丙二醛含量产生影响,敏感品种秦油3号和非敏感品种82089的反应不同。除草剂解毒相关的谷胱甘肽转移酶在酰嘧磺隆处理之后活性下降,然后有所回升并超过初始水平。非敏感品种82089不论叶片还是花蕾,活性降低水平低于敏感性品种Qinyou3,后来提高幅度又大于Qinyou3。这些区别有可能是形成品种间敏感度差异的原因之一。4.2酰嘧磺隆处理花蕾的丙酮酸、可溶性糖、叶绿素含量、类胡萝卜素含量、可溶性蛋白、DNA含量下降,花药DNA呈现弥散状凝胶电泳图谱。处理过的油菜光合速率有下降趋势,但是非敏感品种82089和D89比敏感品种Qinyou3和656下降缓慢,基本保持在原水平,表明光合作用下降也是雄性不育发生的特征之一。4.3在酰嘧磺隆处理油菜后喷施抗坏血酸、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、过氧化氢、水杨酸、硝酸银、尿囊素、赤霉素等,均没有改变育性。补加乙烯利有助于缩短花期。利用酰嘧磺隆+PV+CMCNa+助剂配制的缓释剂处理油菜,提高药物使用剂量,延长了杀雄效果。综合以上结果可以得出本文化学杂交剂的基本作用模式为:酰嘧磺隆、苯磺隆、咪草烟等化学杂交剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶,毒性作用体现在多个层面,包括破坏氨基酸平衡、抑制细胞分裂,干扰DNA和蛋白质代谢、破坏叶绿体和质体结构、抑制光合作用、产生自由基等,最终对小孢子发育过程产生抑制作用。