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肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因，活血化瘀是中医临床用于肿瘤的治则之一。目前对活血化瘀药临床用于治疗肿瘤存在着较大的争论，一种观点认为活血化瘀药可以抑制肿瘤转移，改善肿瘤患者血液高凝状态，防止肿瘤栓子形成，对脱离原发瘤并移行进入血液循环的肿瘤细胞有直接或间接抑杀作用；另一种观点则认为活血化瘀药可以促进肿瘤转移，认为该类药物使肿瘤细胞更易于运行至转移位。因此，研究活血化瘀药物对肿瘤转移的影响及作用机理，对临床运用活血化瘀类中药防治肿瘤及肿瘤转移有现实的意义。本研究主要选取丹参、红花等活血化瘀代表药物，以尿激酶、肝素等抗凝药物作为对照，分析它们对肿瘤转移的影响及作用机理。研究主要由以下几部分组成：第一部分观察活血化瘀药丹参、红花对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的影响。选用C57小鼠，于后肢足垫皮下注射黑色素瘤细胞，造成自发性转移模型；于尾静脉注射黑色素瘤细胞，造成实验性转移模型，观测小鼠肺结节数及肺重量。研究结果显示：对自发性肿瘤转移模型，丹参(指所研究的剂量下，以下同)促进肿瘤的肺转移；对实验性肿瘤转移模型，未观察到结节数的变化，但肺重量增加；对实验性及自发性的转移模型，不论是结节数还是肺重量，红花均无明显的影响，尿激酶对自发性及实验性的肿瘤转移都有促进的转移作用，对实验性肺转移的肺重量没有影响。对自发性及实验性的肿瘤转移模型，肝素钠抑制结节数，对转移模型肺的重量也有减轻作用。发现活血化瘀药对两种转移模型的影响有所不同，提示活血化瘀药丹参、红花影响肿瘤转移的步骤不同。第二部分观察活血化瘀药丹参、红花对黑色素瘤细胞增殖的影响，为下步的研究提供研究剂量依据。采用MTT法研究活血化瘀药对肿瘤细胞增殖能力，肿瘤增殖是肿瘤转移的必要条件，当肿瘤细胞生长到一定的大小时，肿瘤细胞会因缺血缺氧等因素的刺激而形成血管，同时也会改变肿瘤细胞表面的分子特点，从而促进肿瘤细胞的转移。研究结果提示：尿激酶、肝素钠对黑色素瘤细胞的增殖影响较小，而丹参、红花则对肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。第三部分：观察活血化瘀药丹参、红花对肿瘤细胞间及肿瘤细胞与基质间粘附能力的影响。同质型粘附主要由肿瘤细胞表面的粘附分子E-cadherin参与，而异质型粘附则主要由integrin和免疫球蛋白参与。采用琼脂糖阻断细胞与培养板间的粘附，研究肿瘤细胞间的粘附；采用Matrigel作为肿瘤基质的配体，研究肿瘤细胞与基质间的粘附，同时用RT-PCR法研究药物对肿瘤细胞E-cadherin表达的影响。研究结果提示：红花对肿瘤细胞间的粘附有抑制作用，并且可以抑制E-cadherin的表达。肝素钠及尿激酶对同质型粘附及E-cadherin的表达均无影响。丹参对肿瘤细胞间的粘附无影响，但对E-cadherin的表达却有增强作用。肿瘤细胞与基质间的粘附和药物的加入时间有一定的关系，当药物与细胞同时加入时抑制作用较强，而当肿瘤细胞和基质已经粘附时，加入药物则影响较小，红花及丹参对肿瘤细胞与基质间的粘附有较强的抑制作用。第四部分：观察活血化瘀药丹参、红花对肿瘤细胞运动能力的影响。肿瘤细胞的运动能力是影响肿瘤转移的又一个重要因素。利用胶体金可以形成小颗粒，铺于载玻片上，观察肿瘤细胞的运动轨迹；划痕实验是将细胞以较高密度的种植于载玻片上，在细胞间造成等宽的划痕，观察肿瘤细胞整体的运动形式；胶原原位运动侵袭实验是将肿瘤细胞种植于胶原上，在一定时间内观察肿瘤细胞侵袭初期伸出伪足的能力。胶体金吞噬实验表明尿激酶、丹参可以增加肿瘤细胞运动能力，使其运动的面积增加，红花和肝素钠没有影响。划痕实验表明尿激酶、丹参有促进其向中间运动的能力，肝素钠有抑制作用，红花没有影响。对胶原原位运动侵袭的实验表明丹参、尿激酶促进肿瘤细胞在Ⅰ型胶原上伸出伪足，使肿瘤细胞的运动能力增加，促进其向胶原下侵袭，肝素对肿瘤细胞的抑制其伸伪足的作用，红花对肿瘤细胞的伪足没影响。第五部分：体外方法观察活血化瘀药丹参、红花对肿瘤细胞侵袭基质能力的影响。肿瘤细胞侵袭基质的能力是考察肿瘤转移的一个重要的方面，本实验是将基质胶(Matrigel)涂于膜性支持物上，肿瘤细胞种置于上室，观察肿瘤细胞穿过基质膜的作用。研究结果表明：尿激酶、丹参可以促进黑色瘤细胞对Matrigel的侵袭能力，而肝素对黑色素瘤细胞的侵袭能力有抑制作用，红花没有影响。第六部分：观察活血化瘀药丹参、红花对肿瘤细胞分泌金属蛋白酶活性的影响。采用电泳技术及金属蛋白酶可以酶解明胶的特点，对分泌性的MMP-2／MMP-9活性进行考察。研究结果表明：尿激酶对肿瘤细胞分泌的MMP-2有增强作用，对MMP-9的活性没有影响。肝素对MMP-2、MMP-9均有抑制作用，而红花及丹参则对MMP-2和MMP-9的活性都无影响。第七部分：观察活血化瘀药丹参、红花对金属蛋白酶及其抑制剂表达的影响。运用RT-PCR的技术研究活血化瘀药物对它们表达的影响，反映药物对肿瘤转移的影响。研究结果表明：尿激酶能增加MMP-2的表达，对MMP-9的表达没有影响，抑制TIMP-1的表达，对TIMP-2的表达没有影响；丹参则对MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表达有增强作用，对MMP-9的表达没有影响；红花对MMP-9、TIMP-2的表达有抑制作用，对MMP-2、TIMP-1的表达没有影响；肝素能抑制MMP-2的表达，对TIMP-1、TIMP-2的表达也有增强作用，但对MMP-9的表达没有影响。将MMP-2及MMP-9的表达相加，与TIMP-1与TIMP-2之和相比，则可以得到尿激酶、丹参表达的MMP较TIMP多，而肝素则减少MMP与TIMP表达的比值，红花对比值没有影响。第八部分：讨论与结论