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急性T细胞淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是来源于早期T淋巴细胞的高侵袭性恶性肿瘤。目前,治疗仍以化疗作为首选和基础疗法,但超过50%患者出现复发,平均生存时间少于1年,即使行异基因造血干细胞移植,无事件生存(Event-free survival,EFS)亦仅为30%～50%。因此,深入研究T-ALL的发病机制,寻找新的治疗手段,对提高T-ALL患者的长期存活率有着重要意义。Notch/RBP-J信号途径是进化中高度保守的信号途径,通过介导相邻细胞间的相互作用而在多种胚胎前体细胞以及干细胞的分化中发挥重要作用,其异常活化与多种肿瘤的发生密切相关。Notch信号途径与恶性肿瘤的关系最先是在人类T-ALL中被发现。研究显示,9号染色体上Notch1基因和7号染色体上TCR基因的易位,以及Notch基因的点突变造成的Notch信号异常活化是T-ALL形成及维持的主要机制。尽管目前已有应用γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitors,GSIs)抑制Notch信号的活化而针对T-ALL的临床治疗,但文献报道其治疗效果并不理想。究其原因一方面是γ-secretase不是Notch信号特有的,另一方面是GSI只能阻断Notch受体的配体依赖性激活,并不能阻断因染色体易位或Notch基因点突变造成的Notch受体胞内区(Notch intracellular domain,NIC)的非配体依赖性持续活化。证据显示,50%以上T-ALL患者的Notch1异常活化为非配体依赖性活化,因此,寻找广谱的Notch信号抑制剂,对于T-ALL的治疗十分重要。转录因子RBP-J是DNA结合蛋白,可介导哺乳类四种Notch受体的转录激活作用。Aster等研究发现Notch1突变体主要通过与Notch信号关键转录因子RBP-J相互结合而调控下游与T-ALL发生相关基因的表达,应用Notch信号共激活物Mastermind-like1蛋白显性负突变体(DN-MAML1)可以在核内抑制Notch信号。之后,Brandner等基于对DN-MAML结构的分析,合成了一个稳定的-螺旋小肽SAHM1(Stapled -helical peptides derived from MAML1),并证实其可直接阻止Notch转录激活复合物在核内的组装而抑制Notch信号的持续激活。由于DN-MAML和SAHM1都是通过破坏细胞核内表达的Notch1活性结构而抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡,因而相比GSIs,其更能有效地抑制Notch信号的异常活化。然而,由于MAML是具有多种功能的转录激活因子,并不完全特异性作用于Notch信号途径,因此DN-MAML和SAHM1还未能成功应用于人的肿瘤治疗。KyoT2是一种与RBP-J相互作用的LIM结构域蛋白,可与NIC竞争结合RBP-J而抑制RBP-J介导的转录,我们研究组前期通过对KyoT2抑制RBP-J介导的转录调控机制的深入研究,发现PcG (polycomb group)蛋白复合物的组分HPC2和RING1可通过KyoT2与RBP-J相互作用并抑制RBP-J介导的转录激活,同时证实KyoT2主要通过PIAS1-催化小泛素相关修饰反应(Sumoylation)抑制Notch/RBP-J信号途径转录激活。已知小鼠KyoT2在人类的同源物为FHL1C,属于FHL1家族。近期,通过对临床肿瘤标本进行比较microarray谱和免疫组化分析,发现FHL1在多种肿瘤组织中都表达下调,如肺癌,乳腺癌,结肠癌和脑肿瘤等,而我们也发现FHL1C在T-ALL患者中呈低表达。此外,我们研究组发现KyoT2基因剔除小鼠不影响动物生存和主要的生理功能。这些研究提示:在T-ALL中过表达FHL1C可能通过抑制Notch信号途径而阻止T-ALL的发生。基于这样的想法,我们进行了如下实验。主要研究结果:1、成功构建了表达FHL1C的真核表达载体pCMV-myc-FHL1C和pEGFP-C1-FHL1C以及慢病毒表达载体pLenti/V5-FHL1C-IRES-GFP。通过细胞转染、Western-blot、流式细胞仪检测GFP的表达,证实表达载体构建正确。2、通过Amaxa核酸转染仪,在急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞中高效表达了FHL1C。通过细胞绝对数记数、流式细胞仪检测GFP表达、AnnexinV/PI染色、Hoechst核染色以及透射电镜观察Jurkat细胞形态变化等实验,发现在Jurkat细胞中过表达FHL1C可诱导细胞凋亡。3、初步探讨了过表达FHL1C促使Jurkat细胞凋亡的分子机制。报告基因实验证实FHL1C同样可抑制RBP-J介导的Notch信号途径的转录; Western-blot和RT-PCR证实其可抑制下游与T-ALL发生相关分子Hes1、Hes5和c-Myc的表达,促进凋亡相关基因,如Fas和Caspase-3等的表达,抑制抗凋亡基因,如Bcl-2和Bcl-xl等的表达。总之,我们的研究结果显示,过表达FHL1C促进了T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的凋亡,其可能的机制是抑制了Notch信号途径下游与T-ALL发生相关分子Hes1、Hes5和c-Myc的表达和促进了凋亡相关基因的表达。以上这些研究结果提示过表达FHL1C可能对T-ALL具有靶向杀伤作用。该研究将为今后进一步深入研究FHL1C促T-ALL细胞凋亡的分子机制奠定基础,并为以FHL1C为靶标,设计不受细胞微环境影响、并特异靶向RBP-J的新型Notch信号阻断剂提供理论研究基础。